비바이러스 유전자 치료는 만성 요통에 대한 희망을 제공합니다

저널 Biomaterials에 발표된 최근 연구에서 연구자들은 전사 인자 Forkhead를 전달하여 추간성 허리 통증(DBP)을 치료하는 새로운 비바이러스 유전자 치료법을 개발했습니다. 생체 내 퇴행성 추간판(IVD)에 조작된 세포외 소포(eEV)를 사용하는 Box F1(FOXF1).

만성 요통(LBP)은 인구 노령화와 오피오이드 문제 악화로 인해 전 세계적으로 점점 커지고 있는 문제입니다. 현재 치료법에는 단기 완화 또는 값비싼 수술이 포함되어 있어 중독성이 없고 덜 침습적인 치료법의 필요성이 강조되고 있습니다.

성장 인자 투여, 세포 치료, 바이러스 유전자 치료 등 현재의 생물학적 치료법은 동물과 인간 모델의 퇴행을 줄일 수 있습니다. 그러나 단기적인 효과, 낮은 장기 효능, 불필요한 면역원성 및 종양 발생성 등의 우려로 인해 이러한 방법을 직접 적용하는 데 방해가 될 수 있습니다.

이 연구에서 연구자들은 FOXF1-eEV를 사용하여 추간판 변성(IVD)에 대한 비바이러스 유전자 치료법을 확립했습니다.

연구원들은 FOXF1 또는 pCMV6을 대조군으로 포함하는 플라스미드로 일차 마우스 배아 섬유아세포(PMEF)를 형질감염시키고 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 eEV 샘플을 특성화했습니다.

그들은 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)과 기존 PCR을 사용하여 분자 화물을 eEV에 효율적으로 로딩하는 방법을 평가했습니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 eEV 형성에서 FOXF1과 특정 EV 단백질이 확인되었습니다. 연구팀은 기증자 세포에서 FOXF1 플라스미드 DNA의 존재를 확인하고 eEV를 생성하기 위해 업스트림 및 다운스트림 폴리링커 영역을 강화하는 플라스미드를 사용했습니다.

그들은 eEV와 기증자 세포의 플라스미드 DNA에서 생산된 전장 mRNA를 조사했습니다.

연구원들은 DBP 동물 모델에서 조직 기능을 복원하고 통증 반응을 수정하기 위해 전사 인자가 포함된 세포외 소포를 만들었습니다.

그들은 추간판 퇴행의 FOXF1 eEV 억제를 확인하기 위해 추간판성 허리 통증이 있는 마우스 모델에서 FOXF1을 손상된 추간판으로 수송하고 분포시키는 EV를 확인했습니다.

팀은 쥐 추간판의 생체역학적 테스트를 영상, 세포외 기질(ECM) 변화, 12주 후에 평가한 통증 반응과 결합하여 구조와 기능의 변화는 물론 치료 개입으로 인한 통증을 확인했습니다.

수술 전 및 치료 후 통증 평가에는 미세 컴퓨터 단층촬영(micro-CT), 자기공명영상(MRI), 기계적 검사, 알시안 블루(AB) 및 피크로시리우스 레드(PSR) 염색, 디메틸메틸렌 블루 테스트, 면역조직화학(IHC)이 포함되었습니다. ) ).

이 연구에는 수술 후 통증을 조절하기 위해 연구자들이 부프레노르핀 ER을 쥐의 피하 주사하는 수술 기술이 포함되었습니다.

팀에서는 개방형 현장 테스트, 냉각판, 꼬리 매달기, 와이어 매달기 등 다양한 기술을 사용하여 수술 전과 수술 후 4~12주에 2주마다 행동 평가를 실시했습니다.

공개 현장 테스트에서는 생쥐의 자발적인 활동을 평가했습니다. 냉각판 테스트는 열 통각과민증을 측정했습니다. 테일 서스펜션 테스트는 축 통증을 측정했습니다. 와이어 서스펜션 테스트를 통해 강도를 측정했습니다.

수술 12주 후, 팀은 L4와 L5, L5와 L6, L6과 S1 IVD 사이의 추간판을 식별하기 위해 대퇴 신경과 동맥 추적을 사용하여 동물의 요추를 해부했습니다. 그들은 L5/L6 IVD를 사용하여 조직학을 평가하고 글리코사미노글리칸(GAG) 함량을 결정했습니다.

FOXF1 eEV는 디스크 높이, 조직 수화, 프로테오글리칸 함량 및 기계적 특성의 개선을 포함하여 IVD 구조와 기능을 복원하는 동시에 통증 반응을 크게 줄였습니다.

이 연구는 FOXF1 전사 인자로 형질감염된 1차 섬유아세포에서 FOXF1이 탑재된 eEV의 방출에 중점을 두었습니다. 정량적 RT PCR은 pCMV6으로 형질감염된 세포에 비해 FOXF1 mRNA 전사체 수준 및 전체 길이 전사된 FOXF1 mRNA 수준의 유의한 증가를 보여주었습니다.

FOXF1 eEV 요법은 요추 디스크 천자 마우스 모델에서 최대 12주 동안 통증 반응을 감소시킬 수 있습니다. 암컷 생쥐는 병변이 있는 그룹보다 FOXF1을 치료한 그룹에서 획득 시간이 더 길어 치료 후 최소 12주 동안 지속되었습니다.

FOXF1 eEV 요법은 수화 수준과 T2 강조 IVD 이미지 강도를 유지하면서 생체 내 손상 및 퇴행성 동물의 수화 및 IVD 조직 높이를 개선했습니다.

그러나 연구팀은 부상당한 동물과 pCMV6 eEV로 치료한 동물에서 디스크 높이가 감소하는 것을 관찰했습니다. FOXF1 eEV로 치료한 마우스는 치료 후 12주 동안 디스크 높이가 감소하지 않았습니다. 성별은 기능적 결과에 영향을 미치지 않았습니다.

FOXF1 eEV는 생체 내에서 손상되고 퇴화된 IVD의 기계적 기능을 복원했습니다. 축 방향 응력 하에서 FOXF1 eEV 처리 IVD는 손상된 IVD에 비해 더 높은 표준화된 NZ 강성을 나타냈습니다.

크리프 조건에서 손상된 IVD는 정규화된 크리프 변위가 증가하여 정규화된 크리프 탄성 강성이 감소했음을 나타냅니다.

결과에 따르면 손상된 IVD에서 GAG 함량을 줄이면 기계적 유연성이 증가하지만 eEV 치료는 글리코사미노글리칸 손실과 그에 따른 기계적 기능 변화를 방지하는 것으로 나타났습니다.

FOXF1 eEV는 프로테오글리칸과 GAG의 수준을 증가시켜 IVD의 구조적, 기능적 변화를 일으켰습니다.

연구 결과는 발달 전사 인자가 탑재된 eEV가 이러한 전사 인자를 퇴행성 및 통증성 IVD 관절에 전달함으로써 DBP와 같은 통증성 관절 질환을 치료할 수 있음을 보여주었습니다.

이 전략은 질병으로 인한 구조적, 기능적 이상을 줄이고 성별에 따른 통증 반응을 조절하는 데 도움이 될 수 있습니다.

또한 연구자들은 퇴행성 NP 세포를 생체 내에서 동화작용 촉진 상태로 전환하기 위해 FOXF1과 같은 발달 전사 인자를 사용할 것을 권장했습니다. 치료 효과를 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.