흰쥐의 인위적으로 만든 흉터에 동종 각질 세포를 이식하는 실험 작업

세포의 잠재력을 활용하고 흉터의 미적 외관을 개선할 수 있는 새로운 효과적인 방법을 찾아야 한다는 욕구로 인해 각질 세포를 흉터 표면에 이식하는 가능성을 연구하려는 아이디어가 나왔습니다.

각질세포 배양을 이용한 흉터 개선 가능성을 입증하기 위해, 흉터 표면이 형성된 흰 실험쥐를 대상으로 실험 연구를 수행했습니다. 쥐의 척추를 따라 인위적으로 손상된 등을 치유하여 흉터 모델을 만들었습니다. 쥐의 피부에서 2x3cm 크기의 동일한 조각을 잘라냈습니다. "흉터 모델링" 수술 2.5개월 후, 박피술(열가성 물질을 사용하여 흉터의 상층을 제거하는 수술)을 시행하고, 생후 2~4일 된 새끼 쥐의 피부에서 분리한 동종 각질세포를 이식했습니다.

쥐 표피 세포의 분리 및 배양은 러시아 과학 아카데미 세포학 연구소의 세포 기술 연구실에서 다음 기술을 사용하여 수행되었습니다.

피부를 200 U/ml 겐타마이신이 함유된 행크 식염수로 세척하고 0.2~0.5 cm² 면적의 작은 조각으로 자릅니다 ^. 피부 조각을 37°C의 평형 염 인산염 완충 용액에 0.5% 디스파제 용액을 넣고 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 조각을 둘베코 인산염 완충 식염수로 옮겨 표피와 진피를 분리합니다. 표피를 0.125% 트립신 용액에 넣고 50 rpm으로 교반하면서 10~15분 동안 배양합니다. 그 후 5% 태아 소 혈청을 첨가하여 효소 작용을 중단시킵니다. 생성된 세포 현탁액의 3분의 1은 흉터 이식 옵션 중 하나에 순수한 형태로 사용되었고, 나머지 3분의 1은 생체적합성 가정용 필름 코팅 "Polypor"에서, 나머지 3분의 1은 기질 없이 페트리 접시에서 배양했습니다. 쥐의 흉터에 피부연마술을 시행한 후 쥐의 표피 세포를 이식하는 작업은 열 소작술을 사용하여 에테르 마취 하에 수행되었습니다.

첫 번째 그룹의 쥐들은 박피술 후, 멸균된 캠브릭 조각을 윤이 나고 생리용액으로 세척하여 건조시킨 흉터 표면에 얹었습니다. 그 위에 동종 쥐 표피세포를 흔들어 1ml당 150만 세포 농도(세포학 연구소 기준)로 현탁액을 도포했습니다. 캠브릭 조각을 윤이 난 흉터 위에 올려 세포가 흉터 표면에 놓이도록 했습니다. 그 위에 여러 겹의 거즈로 된 붕대를 얹고 흉터 가장자리에 꿰매 붙였습니다.

영어: 얻은 세포 현탁액의 일부를 멸균된 Polypore 필름을 접시 모양으로 자른 페트리 접시에서 접종하고, 다른 일부는 필름이 없는 페트리 접시에 접종했습니다. 배양은 DMEM과 F12 배지를 3:1 비율로 혼합한 FAD 배지에서 수행했습니다. 10% 태아 소 혈청, 5μg/ml 인슐린(Sigma), 0.5μg/ml 히드로코르티손 헤미숙시네이트(Sigma), 10μg/ml 상피 성장 인자 EGF(Institute of Cytology RAS, St. Petersburg)를 첨가했습니다. 두 번째와 세 번째 그룹의 쥐는 각각 7마리씩 첫 번째 그룹 후 6일째에 수술을 받았습니다. 이때쯤 페트리 접시에서 접종한 각질세포 현탁액에서 다층층이 형성되어 쥐에게 이식했습니다. 두 번째 그룹은 필름에 상피세포를 이식했고, 세 번째 그룹은 기질이 없는 다층층으로 이식했습니다. 7일 후, "폴리포어" 필름에 접종된 동종이형 각질세포(MPALK)의 다층층을 상처 부위에 직접 배양하여 이식했습니다. 필름이 찢어지는 것을 방지하기 위해 필름 위에 다층 거즈 붕대를 감아 고정하고 쥐의 피부에 꿰매 붙였습니다.

기질 없이 배양한 세 번째 쥐 그룹에 각질형성세포를 이식하기 전에, 진피-표피 결합을 선택적으로 파괴하는 디스파제(dispase)를 처리하여 페트리 접시 바닥에서 PAC를 분리했습니다. 디스파제는 다층 세포층에 작용할 경우 기저층 세포와 페트리 접시 바닥의 연결을 파괴하고 세포 간 연결에는 훨씬 적은 영향을 미치므로, 층을 완전히 "제거"할 수 있습니다. 디스파제를 이용한 다층 세포층 분리는 다음과 같이 수행했습니다. 페트리 접시에서 수송 배지를 제거하고, 세포층을 항생제, 특히 겐타마이신(0.2 mg/ml)이 함유된 영양 배지로 세 번 세척했습니다. 다층 세포층에 0.125% 디스파제 용액("Sigma")을 채우고 항온조에 넣어 t=37°C에서 20~30분 동안 배양했습니다. 층 주변을 따라 흰색 테두리가 벗겨지는 현상은 페트리 접시 가장자리와 바닥에서 분리가 시작되었음을 나타냅니다. 분리가 시작된 지 몇 분 후, 디스파제 용액을 빼내고 상피층을 배지로 2~3회 세척했습니다. 컵 크기에 맞춰 자른 멸균 상처 드레싱 "리타-컬러"를 상피층 표면에 바르고, 디스파제로 분리된 층을 주걱으로 컵 바닥에서 떼어내 부착했습니다. 눈 핀셋을 사용하여 페트리 접시 바닥에서 냅킨 "리타-컬러"(러시아) 코팅과 함께 층을 떼어내 준비된 흉터 표면에 조심스럽게 옮겼습니다. 냅킨 "리타-컬러"에는 겐타마이신과 엑솔린(콜라겐 추출물)이 함유되어 있는데, 이를 배양 배지의 잔여물로 적신 다음 생리학적 용액으로 적시면 부풀어 오르면서 현대적인 상처 드레싱이 됩니다. 외부 감염으로부터 효과적으로 보호하고 습기를 흡수하는 구조로 인해 빠르게 치유됩니다.

다층 거즈 붕대를 폴리포어 필름과 리타색 냅킨에 부착하고 쥐 피부에 꿰매어 더 강하게 고정했습니다. 이식된 각질세포의 유지 및 생착을 위한 최적의 환경을 조성하기 위해 각 쥐를 별도의 케이지에 두었습니다. 디스파제(dispase)로 제거된 표피세포의 현탁액과 다층층을 이식한 쥐의 붕대는 세포 생착에 가장 유리한 환경을 조성하기 위해 하루에 여러 번 멸균 생리식염수로 적셨습니다. 폴리포어 필름은 물을 통과시키지 않으므로, 두 번째 그룹 쥐의 붕대는 적시지 않았는데, 이는 필름을 사용하지 않은 이식편에 비해 유리한 점 중 하나였습니다. 붕대는 10일 후에 제거했습니다. 세포 이식 후 흉터의 임상 양상은 박피술로 인해 분홍색이 더 뚜렷해지고 더 심하게 벗겨지는 것을 제외하고는 이식하지 않은 흉터와 거의 차이가 없었습니다. 이는... 상처 드레싱이 MPC와 함께 떨어진 직후에는 흉터에 아무런 변화가 없었습니다.

쥐로부터 생검재료를 채취합니다.

흰쥐의 윤이 나는 흉터에 쥐 동종이형 각질형성세포를 이식한 후 1, 2, 5, 9개월 후에 조직학적, 세포형태학적, 전자현미경적 검사를 위해 조직을 채취했습니다. 대조군으로는 정상 쥐 피부와 세포 이식을 하지 않은 흉터 조직을 채취했습니다. 쥐 마취는 에테르 마취를 사용했습니다.

마취 후, 각질세포를 이식한 부위에서 직경 2mm의 생검 펀치를 사용하여 흉터 조직을 채취하고 2.5% 글루타르알데히드 용액에 담가 전자현미경 검사를 위한 조직을 준비했습니다. 조직학적 검사를 위해 채취한 조직은 10% 중성 포르말린 용액에 담가 알코올 용액에 통과시킨 후 파라핀에 포매하고, 초박막 절편을 잘라 광학 현미경으로 관찰했습니다.

대조군 I. 정상 쥐 피부.

정상적인 흉터가 변형된 쥐 피부의 미세한 사진과 MPC 이식 후 특정 시점의 흉터의 차이를 확인하기 위해 이 연구의 모든 단계에서 사진과 설명을 제시했습니다.

정상 피부의 표피는 7~9층의 세포로 구성되어 있습니다. 각질층은 중간 정도의 두께입니다. 어떤 곳에서는 6~8층의 각질 비늘로 이루어져 있습니다. 기저층은 크고 가볍고 규칙적인 모양의 핵과 여러 개의 핵소체를 가진 원통형 세포로 나타납니다. 세포 간 및 기저막과의 데스모솜 연결이 명확하게 표현됩니다. 표피하층에 작은 돌기가 있는 잘 정의된 기저막 아래에는 그와 평행하게 섬세한 콜라겐과 엘라스틴 섬유 다발이 있으며, 그 중에는 길쭉한 섬유아세포와 작은 혈관이 있습니다. 더 깊은 층에서는 콜라겐과 엘라스틴 섬유 다발이 서로 다른 방향으로 놓여 있습니다. 그 중에는 같은 구경의 얇은 벽을 가진 많은 혈관, 세포 요소(섬유아세포, 비만 세포, 백혈구)가 있습니다. 많은 수의 모낭과 피지선이 있습니다.

대조군 2. 쥐의 흉터, 생후 2개월.

임상 양상. 흉터는 옅은 분홍색이며, 벗겨지고 곳곳에 딱지가 남아 있습니다. 콜라겐 섬유의 수축으로 인해 흉터 면적이 감소하여 약 3.0~3.5cm가 되었습니다 ^. 피부 부속기관은 없습니다.

현미경 사진. 표피는 3~5층의 세포로 구성되어 있으며, 접혀져 있으며, 둥근 기저 세포, 한 줄의 치상세포, 그리고 상층에는 각질유리질 입자가 있는 1~2줄의 과립세포로 구성되어 있습니다. 세포 내 부종 부위가 관찰됩니다. 각질층은 매우 얇은 것에서 두꺼워진 것까지 불균일하게 변합니다. 흉터 조직의 수축으로 인해 흉터 접힘이 관찰됩니다. 주름은 유두층까지 침투하여 유두의 흔적을 남깁니다. 표피와 진피의 경계는 직선입니다. 기저막은 모든 부위에 분포하지 않습니다. 표피하층과 심부층의 하부에는 두껍고 느슨한 벽을 가진 혈관들이 있으며, 많은 혈관들이 정체되어 있습니다. 혈관 주변에는 대식세포와 섬유아세포가 축적되어 있습니다. 대식세포는 모세혈관에서 방출된 적혈구를 둘러싸고 식세포 작용을 합니다. 표피층보다 표층인 층에는 작은 모세혈관들이 있습니다. 표피 아래에는 콜라겐 섬유가 느슨하게 분포되어 있습니다. 흉터의 더 깊은 층에는 굵은 콜라겐 섬유 다발이 있으며, 그 안에는 많은 섬유아세포가 있습니다.

쥐 각질세포 이식 1개월 후의 쥐 흉터.

임상 소견. 흉터는 분홍색이며, 면적, 특히 직경이 감소하였고, 평균 2.5~3cm²입니다 ^. 털과 피지선이 없습니다.

필름에 MPaLK를 이식한 쥐와 기질 없이 MPaLK를 이식한 쥐에서 얻은 물질의 현미경 검사 데이터는 거의 동일합니다. 그러나 기술적으로만 보면 기질 없이 MPaLK를 사용하는 것은 기질에서 MPaLK를 배양하는 것보다 훨씬 복잡하고 어렵습니다. 따라서 흉터에 각질세포를 이식하는 문제를 심층적으로 연구하기 위해 다층 캠브릭을 배양("기질")의 기초로 사용했습니다.

현미경 사진. 표피가 15~20층으로 두꺼워진 것이 관찰되며, 각질형성세포는 거의 중앙까지 좁고 길쭉한 수직 모양을 띠며 촘촘하게 배열되어 있습니다. 기저 세포는 불규칙하게 배열되어 있습니다. 핵은 가볍고 크며, 한두 개의 핵소체를 가지고 있어 높은 합성 및 증식 활성을 나타냅니다. 표피와 진피의 경계는 직선입니다. 극상층은 잘 발달되어 있으며, 3~5층의 둥근 세포로 구성되어 있으며, 2개의 핵소체가 있습니다.

기저막 바로 아래에는 얇은 콜라겐 섬유 다발이 빽빽하게 분포되어 있으며, 그 옆에는 많은 수의 버려진 혈관이 나란히 있습니다. 깊은 콜라겐 섬유는 더 굵고, 빽빽한 다발로 모여 있습니다. 많은 큰 섬유아세포, 비만세포(시야에 2~3개), 대식세포, 백혈구, 그리고 버려진 혈관들이 있으며, 혈관벽은 느슨해져 있고, 그 주변에는 콜라겐 섬유가 느슨하게 분포되어 있습니다. 일부 혈관에서는 정체와 형성된 요소의 혈류 유출이 관찰됩니다. 혈관 주변에는 섬유아세포와 단일 림프구가 있습니다. 피부 부속기관은 없습니다.

각질세포 현탁액을 윤이 난 흉터에 이식하면 현미경 사진이 이전 사진과 다릅니다. 대부분의 동물에서 표피는 얇고 5~6층의 세포로 구성되어 있습니다. 하층은 둥글고 불규칙한 핵을 가진 불규칙한 다각형 모양의 세포로 이루어져 있습니다. 표피하층의 상태는 MPALK를 이식하지 않은 동물군과 유사합니다.

이 경우, 세포 이식 과정의 지연 또는 현탁액 형태로 이식된 세포의 대량 손실에 대해 이야기할 수 있습니다. 따라서 각질세포를 현탁액 형태로 이식하여 흉터를 교정하는 것은 비효율적이라는 결론이 도출되었습니다.

쥐 각질세포 이식 2개월 후의 쥐 흉터.

임상 소견입니다. 흉터가 얇고 연약해 보입니다. 곳곳에 벗겨지고 비늘 같은 반점이 관찰됩니다.

현미경 사진. 각질층이 두꺼워지고, 곳곳에 과각화증이 보입니다. 표피는 두꺼워져 12~20줄의 세포로 구성되어 있습니다. 표피와 진피의 경계는 직선입니다. 표피 아래에는 섬세한 콜라겐 섬유가 매우 빽빽하게 분포되어 있습니다. 흉터의 더 깊은 층에서는 크고 굵은 다발로 모여 있습니다. 표피하층에는 새로운 혈관이 형성됩니다. 흉터 조직의 더 낮은 층에는 표피 표면과 평행하게 위치한 많은 버려진 혈관이 있습니다. 큰 섬유아세포가 흉터 두께에 고르게 분포되어 있으며, 거대하고 다분지된 많은 대식세포가 있습니다.

쥐 표피세포를 이식한 지 5개월 후의 쥐 흉터.

임상 소견. 흉터는 고르고 매끈하며 벗겨지지 않았습니다. 털이 한 가닥씩 나 있으며, 흉터 주변부로 갈수록 털이 더 빽빽하게 자라는 것을 볼 수 있습니다. 이는 모낭이 흉터 안으로 서서히 자라 들어가 새로운 모낭이 형성되고 있음을 나타냅니다. 흉터 면적은 지속적으로 감소하고 있습니다.

현미경 사진. 표피는 여전히 두껍습니다(15~20층, 어떤 곳은 최대 30층). 상층은 각질유리질 입자로 채워져 있습니다. 기저막이 뚜렷하게 보입니다. 기저막 아래에는 콜라겐 섬유가 느슨하게 배열되어 있습니다. 하층에서는 콜라겐이 더 강력하고 촘촘하게 뭉쳐 있습니다. 콜라겐 다발 사이에는 많은 모세혈관이 있습니다. 상층에서는 사용하지 않는 혈관의 수가 감소했습니다. 표피와 진피의 경계는 약간 물결 모양입니다. 어떤 곳에서는 흉터 조직에 깊은 표피 돌기가 보입니다. 콜라겐 섬유 사이에 새로 형성된 혈관이 보입니다. 모낭과 피지선이 하나씩 나타납니다.

쥐 상피 MPA 세포를 이식한 지 9개월 후의 쥐 흉터.

임상 양상. 흉터는 이전에 비해 크기가 현저히 작아졌으며, 평균 면적은 약 1.5~2.0cm²입니다 ^. 흉터는 특히 주변부에 잔털로 고르지 않게 덮여 있습니다. 경미한 판상 각질이 남아 있습니다.

현미경 사진.

표피는 더 얇아졌고, 6~8줄의 세포로 구성되어 있으며, 구조적으로는 정상 쥐 피부의 표피와 유사하지만, 세포 밀도는 1mm 더 높고 크기는 더 작습니다. 기저층은 작고 둥근 원통형 세포로 구성되어 있습니다. 기저막은 잘 발현되어 있으며, 반측소체(hemidesmosome)가 명확하게 보입니다. 표피하층에는 표피 돌기가 관찰됩니다. 유두층은 흉터 전체 길이에 걸쳐 발현됩니다. 이러한 사실은 이 시점까지 이식된 각질형성세포와 기저 흉터 조직 간의 접착력이 훨씬 강해졌음을 시사합니다. 따라서 MPC 이식 9개월 후 MPALK 이식 환자의 흉터 관리는 기존 방식과 유사할 수 있습니다. 표피 아래의 콜라겐 섬유는 심층보다 더 섬세합니다. 특히 표층 혈관을 중심으로 많은 혈관이 나타났습니다. 큰 혈관의 벽은 두꺼워져 있습니다. 모낭과 피지선이 다량 존재합니다. 현미경 사진은 진피와 유사한 조직과 유사합니다.

실험 작업의 결과와 논의.

본 연구에서는 다양한 형태의 각질형성세포를 박피술 후 인공적으로 생성된 쥐 피부 흉터에 이식했습니다. 상처 피복재, 캠브릭 현탁액, 그리고 기질 없이 다층막 형태로 이식했습니다. 본 연구는 이식된 동종이형 각질형성세포가 흉터에 미치는 영향에 대한 형태학적 데이터를 확보하고 최적의 이식 방법을 결정하기 위해 수행되었습니다.

세 가지 이식 방법 모두 가능한 것으로 나타났지만, 기판 없이 MPAC를 이식하는 것은 매우 노동 집약적인 과정이며, 이 과정에서 MPAC가 손상될 수 있어 이식 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 이 이식 방법은 넓은 표면에서의 작업을 배제합니다.

각질세포 현탁액 이식은 훨씬 비용 효율적인 방법으로, 장기간의 세포 배양이 필요하지 않으며, 흉터 크기에 맞는 크기의 멸균 캠브릭 블랭크를 사용하는 본 연구에서 제안하는 방식은 간단합니다. 세포 현탁액을 이식할 경우, 상처 코팅에 MPC를 이식할 때보다 치료 효과가 약 한 달 정도 지연되지만, 이는 수개월에 달하는 치료 기간 동안 큰 문제가 되지 않습니다. 화상 환자에게 MPC를 이식할 경우, 피부 구조의 변화는 수년에 걸쳐 점진적으로 진행되는 것으로 알려져 있습니다. 상처 코팅에 각질세포 배양액을 이식하는 것은 가장 편리하고 유망한 방법이지만, 비용이 훨씬 더 많이 듭니다. 또한, 유연하고 흡습성이 있으며, 정균 또는 살균 특성을 가지고 세포에 대해 생물학적으로 중성인 더욱 진보된 코팅 옵션을 모색해야 합니다. "폴리포" 필름은 몇 가지 불완전함에도 불구하고 국내 필름 상처 덮개의 중간 버전이며, 이를 통해 쥐 각질 세포를 흉터에 이식하는 실험을 연구하고 이러한 흉터 치료 방향의 효과에 대한 결론을 도출할 수 있었습니다.

화상 상처에 MPC를 이식한 저자들은 소독된 상처에 다층 각질형성세포층을 이식한 후 첫 주 동안 표피가 두꺼워지고 층화되는 현상을 관찰했습니다. 표피의 모든 층이 명확하게 관찰되었습니다. 흥미롭게도, 이식편의 세포층 수는 피부 생검에서보다 10~30% 더 많았습니다. 저자들은 MPC 이식 후 5일째에 각질유리질 과립이, 그리고 3일째에는 기저막과 반측소체(hemidesmosome)가 관찰되었다고 언급했습니다.

J. Rives 등(1994), Paramonov BA(1996); Kuznetsov NM 등(1998)은 화상 후 전층 피부 결손 환자에게 MPC를 이식한 초기 단계에서 진피와 표피 사이의 연결이 매우 약하고 직선이며 유두층이 없음을 발견했습니다. 2개월째 말에는 얕은 유두와 피부 부속기가 형성되기 시작하고 진피와 표피 사이의 연결이 더 강해집니다. 문헌 자료에 따르면 화상 환자의 상처에 동종 각질형성세포를 이식하는 것이 유망한 방법임이 밝혀졌습니다. 다른 저자에 따르면 동종 각질형성세포는 10일에서 3개월 이내에 거부 반응을 보이지만, 그럼에도 불구하고 상처 표면을 치유하고 성장 인자를 분비하며 결손을 기계적으로 닫는 역할을 합니다. MPALC는 체외 배양 과정에서 랑게르한스 세포를 소실하여 수혜자의 체내에서 장기간 생존할 수 있기 때문에 항원 활성이 감소된 것으로 알려져 있습니다. 또한, 젊고 건강한 사람의 피부에서 채취한 동종이계 배양물은 손상 후 환자의 자가 배양물보다 생물학적 잠재력이 훨씬 더 높습니다.

본 연구의 주요 목표는 동종이형 각질세포가 흉터에 뿌리를 내리는지, 그리고 이러한 생물학적 활성 "상처 코팅"의 영향으로 흉터 조직에 어떤 변화가 발생하는지 확인하는 것이었습니다. 긍정적인 결과가 나올 경우, 이 재활 의학 분야에서 가장 효과적이고 노동 집약도가 낮은 기술을 개발하는 것입니다.

우리가 얻은 데이터는 화상 상처에 동종 각질형성세포를 이식한 후 인간 표피에서 발생하는 형태학적 변화에 대한 문헌 데이터와 여러 면에서 유사했습니다. 그러나 이식이 발생하는 형태학적 기질과 기술 측면에서도 상당한 차이가 있습니다. 따라서 기저막과 진피-표피 연결(반흔소체, 유두)의 형성 과정은 흉터 변화 없이 각질형성세포를 상처 표면에 이식하는 것보다 더 늦은 단계에서 발생합니다. 이는 진피 또는 근육 근막에 비해 흉터 조직의 영양 상태가 좋지 않기 때문에 발생하는 것으로 보입니다. 특히 오래된 흉터는 혈관이 매우 적은 치밀한 결합 조직인 반면, 화상 상처의 바닥은 혈관이 풍부한 육아조직입니다. 따라서 각질형성세포의 이식과 생착이 발생하는 조건이 절대적으로 다르다는 것은 분명합니다. 세포 이식 부위의 혈관이 많을수록 생착 과정이 더 수월해집니다. 이러한 가정을 바탕으로 결합 조직이 아직 상당히 느슨하고 혈관이 풍부한 젊은 흉터를 사용하는 것이 더 바람직하다는 결론이 도출됩니다.

이 실험 작업의 결과로 다음 사실이 증명되었습니다.

1. MPALK를 흉터에 이식하는 것이 가능합니다.
2. 최적의 이식 방법은 상처 부위에 각질세포를 이식하는 것입니다.
3. 수술용 레이저 피부연마술이나 슈만 커터를 사용하여 흉터 표면을 연마해야 합니다.
4. MPALK의 영향으로 흉터의 광택 표면에서 빠른 상피화가 일어납니다.
5. 흉터 조직의 혈관이 잘 발달할수록, 즉 흉터가 어릴수록 각질세포 이식의 결과가 더 좋습니다.
6. 이식된 각질 세포의 영향으로 흉터 조직은 점차 변형되어 진피와 같은 조직(피부 부속물이 있는 느슨한 흉터 조직)으로 변합니다.
7. 표피하층부터 시작하여 흉터 조직이 점진적으로 느슨해집니다. 혈관 형성이 개선되고, 흉터의 윗부분과 아랫부분의 콜라겐 섬유 다발은 세포 이식을 하지 않은 흉터 조직보다 더 느슨하게 배열됩니다. 모낭과 피지선이 나타납니다. 표피는 비대기를 거쳐 구조적으로 정상 피부의 표피와 유사해집니다.
8. 관찰된 변화는 각질 세포에서 분비되는 성장 인자와 사이토카인과 관련이 있는데, 이는 흉터 조직의 영양성을 개선하여 거친 섬유 조직에서 느슨한 조직으로의 변형을 촉진하고, 결과적으로 흉터의 모양이 개선됩니다.

따라서 이 연구를 바탕으로, 이식된 각질 세포가 흉터 조직에 유익한 효과를 미치는 것으로 결론 내릴 수 있으며, 이는 다양한 유형의 흉터를 가진 환자의 재활에 실질적인 영향을 미칠 수 있습니다.

쥐를 대상으로 한 이 연구를 통해 각질세포가 자라는 상처 덮개에 대한 요구 사항을 공식화할 수 있었습니다.

상처 드레싱은 다음과 같아야 합니다.

• 세포와 생체적합성이 있는
• 통기성이 좋은,
• 탄력 있고 형태를 형성하는 기초를 가지고 있습니다.
• 친수성이 있어야 한다
• 의약 첨가제에는 배양된 세포에 독성이 없는 항균제와 항산화제가 포함되어 있습니다.

생명공학적 흉터 치료의 임상 결과.

이전에 N. Carver 외(1993)는 폐쇄성 드레싱이 상처 부위에 부착하고 각질세포의 생존을 촉진하지만, 성숙한 중층 표피 형성은 방해한다는 것을 발견했습니다. 중층 표피 형성에는 공기 환경이 필수적입니다. 따라서 다층 드레싱 부착 후 7~10일 후에 폐쇄성 상처 드레싱을 제거하고 건식 드레싱이나 수용성 연고를 사용하여 상처를 치료하는 것이 제안되었습니다. 세포가 자라는 "기질"의 품질과 특성은 세포 물질 이식의 효과와 결과적으로 의사의 치료 결과에 매우 중요한 요소라고 할 수 있습니다. 그러나 인공 피부, 카르복시메틸셀룰로오스 부직포, 피브린 코팅, 반투과성 폴리우레탄 필름 등 다양한 대안이 제시되고 있음에도 불구하고, 오늘날 이상적인 상처 드레싱은 존재하지 않습니다. 이 문제에서 중요한 점은 "기질"(특수 상처 덮개)의 비용입니다. 기질의 높은 비용으로 인해 생명공학적 치료의 전체 비용이 증가합니다.

세포 기술의 효과는 현재까지 입증되었지만, 안타깝게도 이러한 기술은 매우 고가이며, 특히 세포 조성의 산업적 생산이 확립되지 않은 국가에서는 더욱 그렇습니다. 그러나 미국과 같은 국가들은 오랫동안 화상 이식용 세포 물질 생산 산업을 발전시켜 왔습니다. 특히 BioSurface Technology Inc.는 1989년부터 37,000개의 다층 각질세포층을 배양하여 전 세계 79개국 240명의 환자를 치료했습니다(R. Odessey, 1992). 1cm²의 ^세포 배양 비용은 약 7~8달러입니다.

다양한 피부 질환과 문제를 치료하는 기술은 여러 가지 차이점이 있지만, 모든 세포 치료는 고품질의 세포 물질을 확보하고 이를 이식하는 것을 기반으로 합니다.

이 과정은 다음 단계로 구성됩니다.

• 피해자(또는 기증자)의 피부를 채취하고,
• 피부 플랩을 생명공학 센터로 운반,
• 기저층 세포의 분리 및 증식,
• 다층 각질세포층(MLK)의 성장.
• 세포 배양 이식.

다층 각질세포 시트 이식을 이용한 치료의 주요 문제점은 세포 이식의 모든 단계에서 생존 가능한 세포가 필요하다는 것입니다. 자가 또는 동종이형 세포를 분리하기 위한 피부 조각은 가능한 한 얇아야 합니다. 이 경우 기계적 및 효소적 방법을 사용하여 분리하고 배양을 위한 살아있는 세포 현탁액을 얻기가 더 쉽기 때문입니다. 피부절편을 사용하거나 눈꺼풀, 포피, 어깨 안쪽 피부를 사용하여 채취할 수 있습니다. 세포는 할로겐(염소, 요오드)과 과산화수소에 민감하기 때문에, 재료 채취 시 피부 처리에는 사용할 수 없습니다.

피부 이식편에서 채취한 세포의 양적 및 질적 수율과 배양 효율은 기증자의 건강 상태와 연령에 따라 달라집니다. 또한, 피부 생검은 가능한 한 빨리 적절한 조건(환경, 온도)에서 이러한 목적으로 인증 및 공인된 실험실로 전달되어야 합니다.

피부 플랩의 보관 및 운반을 위해 10% 우혈청을 첨가한 이글배지 또는 배지 199, 5% 태아우혈청을 첨가한 DMEM 배지와 항생제를 사용할 수 있습니다.

세포학 연구실에서는 피부 생검 조직을 먼저 기계적으로 작은 조각으로 나누고, 그런 다음 트립신, 콜라게나제, 디스파제 등의 효소를 사용하여 피부 조각을 처리합니다.

효소 작용으로 데스모솜이 파괴되고 각질형성세포는 개별 세포 또는 다양한 수의 세포로 구성된 응집체 형태로 배지 내로 방출됩니다. 배양에는 기저 각질형성세포만 사용되며, 이 각질형성세포는 5% CO2가 포함된 항온조, 페트리 접시 또는 t = 37°C의 플라스크에서 배양합니다. 48시간 후, 각질형성세포 군집이 형성되는 것이 관찰되며, 점차 합쳐져 단층으로 변합니다. 충분한 수의 세포를 받은 후, 생성된 현탁액을 이 목적으로 준비된 상처 드레싱에 접종하고 페트리 접시에 놓습니다. 먼저, 각질형성세포의 단층, 그리고 다층층이 현탁액에서 형성됩니다. 각질형성세포 배양 과정의 단계는 그림 12(33, 43, 54, 65)에 개략적으로 나와 있습니다.

이식에 적합한 다층 각질세포층이 형성되는 데는 보통 7~10일이 걸립니다. 때로는 이 기간이 더 길어질 수 있는데, 이는 기증자의 나이, 건강 상태, 채취 방법의 정확성, 사용된 배지의 품질 등 공급 물질의 품질에 따라 달라집니다. 다층 각질세포층이 과도하게 증식하면, 이식에 적합하지 않은 세포자멸사 현상이 나타나는 세포가 표면에 나타날 수 있습니다. 상처 부위에 다층 각질세포층(MLK)이 배양된 페트리 접시는 최소 +15°C의 온도에서 특수 용기에 담겨 병원으로 배송됩니다.

MPC 성장을 위한 수정된 Green 방법

저희는 쥐 실험에서 사용했던 "폴리포(Polypor)" 필름 대신 다층 캠브릭을 상처 피복재로 사용했습니다. 따라서 탈지 및 멸균된 캠브릭에 다층 각질세포층을 배양했지만, 이 역시 최적의 상처 피복재는 아닙니다.

필요한 윤리 기준을 준수하여 자원봉사자를 대상으로 임상 연구가 수행되었습니다. 즉, 계약서에 서명하고 정보에 입각한 동의를 얻는 것입니다.

1. 환자 본인의 각질세포(자가세포)와 은행에 보관된 각질세포(이종이식세포)를 배양하여 사용했습니다.
2. 환자의 각질세포는 환자의 팔 안쪽 상완부에서 잘라낸 피부 조각에서 얻었습니다.
3. 흉터 피부연마 수술은 열소작술, 회전 디스크 및 에르븀 레이저를 사용하여 수행되었습니다.
4. 정상 위축성, 비대성, 비대성 흉터가 있는 환자 그룹을 선정했습니다.

피부 흉터의 모양을 개선하기 위해 세포 기술을 적용하는 기술적 과정은 다음과 같은 단계로 구성됩니다.

1. 환자 선택.
2. 치료의 본질에 대한 설명, 예상 결과를 얻기 위한 기간, 계약서 서명 및 정보 동의.
3. 수술 2~3주 전에 환자에게 셀메비트 1정을 하루 3회, 징크테랄 1정을 하루 3회 처방합니다.
4. 어깨 안쪽 표면, 겨드랑이 부위 아랫부분 높이에서 길이 2.0cm, 너비 0.7~1.0cm의 피부 조각을 채취하여 자가 각질세포를 채취합니다.
5. 환자가 어깨 안쪽 표면에 선형 흉터가 생길 가능성 때문에 자신의 각질세포를 분리하는 것을 거부한 경우, 세포 은행(이종 각질세포)에서 세포 물질을 채취했습니다.
6. 각질세포를 분리하여 이런 종류의 작업에 대한 인증을 받은 실험실에서 배양했습니다.
7. 흉터에 이식할 만큼 충분한 양의 MPC를 얻은 후, 병원에서 수술 날짜를 정하고, 재료를 페트리 접시에 담긴 특수 용기에 담아 옮겼습니다.
8. 흉터 박피술을 시행하고 지혈한 후, 연마된 표면을 멸균 식염수로 세척하고 건조시킨 후, MPC를 멸균 캠브릭 "세포가 아래로" 이식했습니다. 즉, MPC의 위쪽에 있던 세포가 연마된 표면에 인접한 아래쪽에 위치하게 되었습니다.
9. 멸균 필름을 위에 씌우고 탄력 붕대나 탄력 붕대인 옴니픽스(Omnifix)로 피부에 고정했습니다. 필름 대신 메피텔(Mepitel), 메피폼(Mepiform), 실리콘 젤 시트와 같은 실리콘 함유 상처 드레싱을 사용할 수 있습니다.

5~7일 후, 필름이나 실리콘 코팅이 제거됩니다. 이때쯤이면 모든 각질세포가 윤이 나는 흉터 위로 기어올라 표면에 부착되어 있어야 합니다.

10. 필름과 실리콘 코팅 아래에 형성된 습한 환경이 이러한 현상에 적극적으로 기여합니다. 이 시점부터 흉터에 남아 있는 캠브릭은 큐리오신이나 키토산 젤에 적셔질 수 있습니다. 결과적으로 2일째 되는 날, 치밀한 딱지가 형성되며, 환자의 편의를 위해 옴니픽스와 같은 탄력 있고 통기성이 좋은 패치로 고정하는 것이 가장 좋습니다. 통기성 딱지는 형성된 표피가 분화되어 성숙한 표피로 변하는 것을 가능하게 합니다.

흉터의 종류와 연삭 깊이에 따라 붕대는 8~10일 후에 제거됩니다. 이 시기의 표피는 정상 피부보다 세포층이 30~40% 더 많습니다. 기저막은 형성되지 않습니다. 두꺼워진 표피의 각질형성세포는 많은 생물학적 활성 분자를 흉터 조직으로 분비합니다.

생명공학적 흉터 치료의 성공은 수술 후 관리 방법에 크게 좌우됩니다. 세포 배양은 "부드러운" 상처 치료이며, 이식 후 초기에는 내피세포(IPC)가 기저 조직에서 쉽게 벗겨질 수 있습니다. 따라서 수술 후 흉터를 조심스럽게 다루는 것이 좋습니다. 8~9개월 동안은 문지르지 말고 차가운 끓인 물로 부드럽게 치료하여 기저 조직과 단단히 결합되지 않은 얇고 새롭게 형성된 표피가 벗겨지는 것을 방지해야 합니다.

메모.

수술 전과 박피술 중에는 할로겐화 소독제 및 산화제(요오드피론, 설리오도피론, 요오드놀, 요오드산염, 클로르헥시딘, 과산화수소) 사용이 허용되지만, 세포 이식 전에는 세포독성 때문에 엄격히 금기입니다. 메틸렌 블루와 브릴리언트 그린 또한 세포에 독성이 있습니다.

특히 비대성 흉터 수술 시 감염을 예방하기 위해 수술 부위를 네오마이신 황산염, 폴리믹신 또는 겐타마이신으로 치료할 수 있습니다. 이러한 약물은 각질세포에 세포독성을 나타내지 않습니다.

이러한 치료의 결과로 3중 효과가 달성됩니다.

1. 흉터 표면을 평평하게 만듭니다.
2. 그 위에 정상 두께의 새로운 표피층이 생성됩니다.
3. 이식된 세포에서 분비되고 각질형 세포, 섬유아세포, 대식세포에 의해 자극되는 사이토카인, 성장 인자 및 기타 생물학적으로 활성한 분자의 작용으로 인해 흉터 조직이 진피와 유사한 조직으로 변형됩니다.

흉터는 눈에 띄지 않게 되고, 탄력이 생기며, 모공과 솜털이 나타나고, IPC에 멜라닌 세포가 존재하기 때문에 색소침착이 회복될 수 있습니다.

그러나 흉터의 이러한 모든 긍정적인 측면은 즉시 나타나지 않습니다. 따라서 흉터 조직이 진피 조직으로 전환되는 과정은 느리게 진행되며, 이러한 치료의 최적의 결과는 10~14개월 후에야 나타날 수 있다는 점을 환자에게 알려야 합니다. 드레싱 제거 직후, 연마된 표면은 뚜렷한 다색성을 띠며, 연마가 더 깊을수록 더 밝아집니다. 에르븀 레이저를 사용하여 정상 위축성 흉터를 연마할 때 피부 손상이 가장 적습니다. 흉터와 주변 피부의 색은 3~8주 이내에 회복됩니다. 이러한 예방 조치에도 불구하고 수술 후 과색소 침착이 발생할 수 있으며, 이는 몇 개월 내에 저절로 사라질 수 있습니다.

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