결핵에 대한 실험실 진단

결핵은 현대적인 조건과 과학적 성과에서 쉽게 진단 할 수있는 질병입니다. 결핵의 검사실 진단은 다른 진단법의 핵심이며 두 번째는 X 선 검사법에 이어 두 번째입니다.

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임상 혈액 검사

결핵 환자에서 혈액의 일반적인 분석의 변화는 병적 인 것은 아닙니다. 정상적인 양의 적혈구의 결핵 hypochromia 특성의 제한 및 비활성 형태로. 때 대규모 침윤 또는 caseous 폐렴, 동안 caseous 림프절염, 특정 장 병변뿐만 아니라 대형 폐 또는 수술 후 출혈 및 노트 erythropenia의 작은 적혈구, oligohromaziyu, polihromaziyu의 보급. 대 식세포 증, 특히 poikilotsitoz는 대개 덜 빈번하게 만나며, 보통 심한 빈혈이 있습니다. 0.6 내지 1.0 %와 1 % 대상성 망상 특징 - 단계 결핵에서 망상 적혈구의 수와 subcompensated는 0.1 내지 0.6 %의 범위를 보상.

파괴적이고 진보적 인 폐결핵으로 - 어떤 경우에는 결핵은 제한적이고 쉬운 과정 발생하는 형태와 12.5 %의 환자 2-7 %에서 발생 (. 백혈구 15,000까지) 중간 leucocytosis, 적은 방사선을있을 수 있습니다 때 .

가장 빈번한 교대는 백혈구 공식에서 생깁니다. Promyelocytes 전에 왼쪽으로 백혈구 수식의 적당한 교대 상대적 및 절대 neutrophilia를 표시합니다. Myelocytes는 단순한 결핵의 경우에는 매우 드뭅니다. Haemogram 결핵 환자의 비정상 입자와 호중구의 수를 증가시키는 것은 항상 프로세스의 기간을 나타냅니다 중증 결핵 환자의 거의 모든 호중구가 비정상 입자가 포함되어 있습니다. 결핵 발병이 끝나면 핵 동위 원소가 비교적 빨리 정상에 접근합니다. 호중구의 병적 세분성은 일반적으로 헤모 그램의 다른 변화보다 오래 지속됩니다.

말초 혈액에서 호산구의 함량은 과정의 단계와 유기체의 알레르기 상태에 따라 다릅니다. 그들의 수는 감소 질병의 심각하고 장기간의 발생에 aneozinofiliya 때까지, 역으로 재 흡수 침윤과 흉수뿐만 아니라 차 결핵의 초기 형태로 증가한다.

대부분의 형태의 원발성 결핵에는 림프구 감소증이 동반되며, 림프구 감소증은 특정 변화의 흉터가 있더라도 수년 동안 관찰되는 경우가 있습니다. 악화 단계의 이차 결핵은 과정의 중증도에 따라 정상 림프구 수 또는 림프구 감소를 동반 할 수 있습니다.

또한 결핵 프로세스 (ESR) 유동 결핵 프로세스 평가 및 활성 형태를 식별하는 값을 가지는 평가하는 적혈구 침강 속도 테스트를 추가로 결정하는 특별한 장소를 차지한다. ESR의 증가는 병리학 적 과정 (감염성 염증, 화농성 패혈증, hemoblastosis, 호 지킨 등.)의 존재를 나타냅니다 심각도를 표시하지만, 보통의 수준은 항상하지 ESR 병리학의 부재를 나타냅니다. 적혈구 침강의 가속 글로불린, 피브리노겐, 콜레스테롤의 혈중 농도의 증가에 기여하고, 혈액 점도를 감소. 적혈구 침강의 감속은 hemoconcentration을 수반하는 상태, 즉 albumins과 bile acids의 함량이 증가한 경우에 특징적입니다.

결핵 환자의 hemogram은 치료 중 변경됩니다. 혈액 학적 변화가 사라질수록 치료 적 개입이 더 성공적이됩니다. 그러나 다양한 항균 약물의 조혈 효과에 유의해야합니다. 그들은 종종 호산구 증가증을 일으키고, 어떤 경우에는 백혈구 증가증을 일으키며 백혈구 감소증과 무과립구증 및 림프 성 - 망상 반응을 일으킬 수 있습니다. 환자의 임상 상태, 과정의 역 동성 및 사용 된 치료의 효과를 평가하기 위해서는 체계적인 혈액 학적 관리와 얻어진 데이터의 정확한 분석이 필수적입니다.

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소변의 임상 분석

비뇨기 시스템의 결핵과 함께, 소변 검사는 주요 검사실 진단 방법입니다. 백혈구 증, 적혈구 증가증, 단백뇨, hypoisostenuria, 결핵 mycobacterium, 비 특이성 세균 뇨증을 관찰 할 수 있습니다.

Leucocyturia - 비뇨 기관의 결핵 화학 요법과 그러한 요관의 내강의 완전한 소멸과 같은 예외적 인 경우에 특정이없는 가장 일반적인 증상. Nechyporenko 테스트 (소변의 1 ㎖의 백혈구 수의 측정)를 객관적으로 차수 leukocyturia의 nefrotuberkuloze을 평가하는 데 도움이, 어떤 경우에는 정상적인 뇨에서이를 식별하기. 그러나 급성 및 만성 신우 신염, 방광염, 요도염, 신장 및 요로 결석에서 백혈구 감소증이 발생할 수 있다는 점을 고려해야합니다.

적혈구 감소증. 백혈구 감소증이 있습니다. 비뇨 생식기 시스템의 결핵에 대한 가장 빈번한 실험실 징후 중 하나로 간주됩니다. 혈뇨의 빈도는 과정의 유병율에 달려 있으며, 신장에서 결핵성 폐렴 과정이 진행됨에 따라 증가합니다. 백혈구 감소증이없는 적혈구 감소증은 신장 결핵의 초기 단계에서 더 전형적입니다. 백혈구 증을 압도하는 혈뇨는 비 특이성 신우 신염과의 분화에서 신장 결핵에 찬성하여 중요한 주장이다.

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생화학 적 혈액 검사

결핵으로 인한 생화학 적 매개 변수의 변화는 주로 과정의 단계, 합병증 및 다양한 수반되는 질병에 달려 있습니다. 폐 및 기타 기관의 활동성 결핵 환자에서 혈청의 총 단백질 및 단백질 분율은 변하지 않으며 정상적인 내용을 결정합니다.

만성 형태의 결핵의 악화 및 진행뿐만 아니라 급성 형태의 질병에서 알부민 - 글로불린 계수는 감소합니다.

결핵 합병증 유기 간 손상의 기능적 상태를 평가하는데 필수적인 혈청 총 직접 빌리루빈, AST (ACT)와 ALT의 판정이다. 아미노 전이 효소의 수준을 동적으로 측정. 특히 심한 형태의 결핵 환자 치료 용 빌리루빈은 결핵 환자의 생화학 검사의 필수 구성 요소이며 매월 수행됩니다.

신장 기능 상태의 평가에는 Cockcroft-Gault 공식에 따라 혈청 크레아티닌 측정 및 사구체 여과율 계산이 포함됩니다. Reberg의 표본을 사용하여 사구체 여과율을 계산하면 정확도가 떨어집니다.

결핵 환자에 대한 역동적 인 생화학 적 연구의 주요 목표는 과정의 진행 과정, 약물의 부작용을 적시에 감지하고 발생하는 항상성 장애를 적절하게 교정하는 것입니다.

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비 폐결핵에 대한 생화학 적 조사 방법의 적용

가장 유익한 지표는 생물학적 체액 중 결핵 스테아르 산 (tuberculostearic acid)의 함량이지만, 그 정의는 기술적 어려움 (가스 크로마토 그래피 및 질량 분석법의 필요성)과 관련되어 있습니다.

액체에서 결정되는 효소 인 아데노신 디아 미나 아제의 활성 측정 : 활액막, 심낭, 복수 또는 척추. 아데노신 디아 미나 제의 주요 생산자는 임파구와 단구입니다. 생물학적 유체에서 아데노신 데 아미나 활동의 결정은 결핵성 활막염, 림프절 결핵, 결핵성 수막염, 결핵성 serozity의 진단을 용이하게합니다.

비특이적 인 특성으로 인해 일부 생화학 지표는 병변 초점에 가까운 생물학적 체액에서만 결정됩니다. 투베르쿨린의 피하 또는 피내 주사에 대한 반응으로 지표의 수준을 측정하십시오 (일반적으로 48 시간 전과 72 시간 후). 이 후, 마커 레벨의 증가 정도 (% 단위)가 초기 레벨에 대해 계산됩니다.

Transamnidase의 기관 특이 적 효소의 활성 소변에서의 최적 측정. 다양한 자연의 신장이 영향을받을 때 나타나는 것으로 나타납니다. 트랜스 아미 디나 제의 연구는 국소 염증 과정을 악화시키기 위해 투베르쿨린의 피하 주사 조건 하에서 만 정당화된다. 처음에는 소변에서 트랜스 아미 딘의 활성을 결정하고 50 TE 투베르쿨린 도입 후 24-72 시간. 발효 2 배 이상으로 확대되면 신장의 활동성 결핵과 만성 신우 신염의 악화를 구분하는 경우가 82 %입니다.

여성 생식기의 결핵으로 인해, 도발 트립신 검사의 조건에서 혈중의 합 토글 로빈 및 말 론산 디 알데히드의 농도가 결정됩니다. 피하 투여 된 투베르쿨린을 50TE 및 72 시간 후에 2 차 생화학 적 연구를 수행 하였다. 결핵 발병의 경우, 합 토글 로빈 수준의 증가 정도는 28 % 이상이고, 말 론디 알데히드의 수준은 39 % 이상이다. 더글라스 공간에서 얻은 복막 액에서 아데노신 디아 미나 아제의 활성도 측정합니다. 점막은 0.1TE와 0.01TU의 투베르쿨린을 정맥 내 주사 한 후 72 시간 후에 재발하여 전방 복부 벽의 내부 생식기를 투영합니다. 결핵에 유리하게 아데노신 데 아미나 제의 활성 증가는 초기 결핵과 비교하여 10 % 이상 증가합니다.

눈이 영향을 받으면 항원 자극에 대한 반응으로 눈에서 일어나는 초점 반응을 검사합니다. 시각적 기능의 저하와 함께 뚜렷한 반응을 나타내는 것은 바람직하지 않습니다. 최소 초점 반응의 평가가 어려운 경우가 많으므로, 결론을 객관화하기 위해 합 토글 로빈 또는 아데노신 디아 미나 아제의 혈청에서의 성장 정도와 병행하여 방향을 맞추는 것이 좋습니다.

모든 생화학 적 연구는 다른 방법과 함께 수행되어야한다.

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혈액 응고 시스템 연구

TB의 혈액 응고 시스템의 연구 상태의 관련성은 결핵의 수술 적 치료에서 폐 결핵 haemoptysis 또는 폐 출혈뿐만 아니라 hemocoagulation 합병증이있는 환자의 수의 존재에 의해 발생합니다. 또한, 결핵에 자연적으로 수반되는 혈관 내 응고 응고의 잠복 류가 질병 경과 및 화학 요법의 효과에 영향을 미친다.

혈액의 항 응고 활성이 관찰 된 감소 삼출성 염증 구성 요소의 폐 결핵 유병률이있는 환자에서. 약간 발현 생산 hemocoagulation 혈관 염증 성분의 우세와 폐의 특정 환부의 낮은 발병률 환자. 객혈 및 폐 출혈 상태 혈액 응고 시스템과 폐결핵 환자에서 다른 : 증가 "구조"응고를 유지하면서 자사의 종료 높이 gemoptoe이나 직후 낮은 출혈 환자에서 혈액 응고 능력의 급격한 증가로 인해 trombinoobrazovaniya의 심각한 강화에있다. 대량 출혈 환자에서 피브리노겐의 농도를 낮추는 비용 감소 응고 잠재력을 관찰했다. 인자 XIII 활성도, 혈소판 수. 시스템 항상성가 발생 중대한 위반과 폐결핵의 제한된 형태의 환자에서 수술 적 치료의 단계에서. Pnevmon- 또는 plevropnevmonektomii의 실행에 널리 공정 환자는 자주의 형태로 취할 수 DIC 개발, "두 번째 병을."

폐결핵은 활성화 부분 트롬 보 플라 스틴 시간을 결정 (APTT), 피브리노겐, 트롬빈 시간, 프로트롬빈 인덱스 및 출혈 시간과 응고 시간을 실시한다 환자의 혈액 응고의 상태를 모니터링한다.

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호르몬 연구

최근의 실험적 및 임상 적 관찰은 특정 결핵성 폐 염증에서 호르몬 상태의 변화가 있음을 나타냅니다. 안티-TB 치료와 함께 뇌하수체 - 부신, 뇌하수체 - 갑상선 시스템의 기능 장애 및 췌장 기능의 보정 궤적 특정 염증으로 섬유화 및 수리의 활성화에 기여하는 것을 증명한다.

뇌하수체 갑상선 시스템의 기능적 상태 트리 요오 도티 로닌 (T의 혈청의 내용에 의해 판정 ₃ ), 티록신 (T ₄ ), 뇌하수체, 갑상선 자극 호르몬 (TSH). 그것은 무증상 갑상선 기능 저하증은 폐결핵 환자의 38~45%에서 검출되며, 대부분이 파종 및 석면 - 동굴 형성 과정을 진단하였습니다. 이 같은 형태에서 가장 극적으로 감소 모두 T의 레벨 ₃ 와 T ₄,이 호르몬의 불균형이 T의 비율 증가의 형태가 온다 _네 / T _들.

부신 피질의 기능은 혈청의 코티솔 수준과 면역 반응성 인슐린의 농도에 의한 췌장의 점진적인 기능에 의해 평가됩니다. 감염성 질환의 급성기에는 내인성 코티솔과 인슐린이 필요합니다. 고 인슐린 혈증은 또한 신체 조직의 인슐린 저항성을 증진시킵니다. 이는 특히 활성 염증 과정에서 전형적입니다. 활성 폐결핵이있는 부신 땀샘의 글루코 코르티코이드 기능을 측정하면 대다수의 환자에서 대뇌 피질 증의 존재를 알 수 있습니다. 급성시기에 감염 염증 환자에서 혈중 코르티솔 농도가 정상 수준을 글루코 코르티코이드 투여 량의 적절한 대체 요법을 유지하기위한 기초로서 역할을 할 수있는 부 신피질 스테로이드의 함수의 상대 실패로 간주되어야한다.

폐결핵 환자의 약 1/3은 저혈당증의 수치가 매우 낮고 표준의 하한선에 도달하는 반면 13-20 %는 심각한 고 인슐린증을 관찰 할 수 있습니다. 상대 hypo- 및 hyperinsulinism은 다양한 정도의 탄수화물 대사에 대한 위반의 발병 위험이 높습니다. 췌장의 B 세포의 기능적 활성의 이러한 변화는 당뇨병 환자의 결핵 및 적시 예방 환자에서 혈당을 정기적으로 모니터링해야합니다. 또한. 이는 결핵의 복합 요법에서 인슐린의 생리적 복용량을 사용하는 편의를위한 추가 정당화의 역할을합니다.

갑상선 호르몬과 광범위한 폐 손상 및 결핵 중독의 심각한 증상 결핵 과정의 심각한 물론 환자 자신의 불균형 hypercortisolemia 및 고 인슐린 혈증 큰 범위의 일반적으로 낮은 수준에서.

결핵에 대한 미생물 학적 진단

미생물 학적 연구는 결핵 환자 확인, 진단 확인, 화학 요법 모니터링 및 교정, 치료 결과 평가, 다시 말하면 환자가 결핵에 걸린 순간부터 결정해야합니다.

모든 역학 프로그램과 프로젝트는 세균 배설물의 수에 대한 평가를 기반으로하며, 이는 미코 박테리아 결핵을 탐지하는 실험실 방법을 사용하지 않고는 수행 할 수 없습니다. 소위 조직화되지 않은 인구에 대한 조사에서 박테리아 침입자의 비율은 70 이상이되어 실험실 방법이이 인구 집단 중 결핵 환자를 식별하는 데 충분한 효과적인 수단이됩니다.

결핵 진단을위한 전통적인 미생물 학적 방법은 세균 및 배양 검사입니다. 현대의 방법은 PCR의 설정 인 자동화 시스템에서 결핵균 배양을 고려합니다. 그러나 이러한 모든 방법은 반드시 고전적인 세균 학적 방법과 결합해야합니다.

진단 자료 수집

실험실 연구의 효율성은 진단 물질의 품질에 크게 좌우됩니다. 진단 물질의 수집, 보관 및 운송에 대한 규칙 준수 및 환자 평가 알고리즘의 정확한 구현은 결과에 직접적인 영향을 미치고 생물학적 안전을 보장합니다.

결핵 검사에는 다양한 재료가 사용됩니다. 사실로 인해 그 TB logkih- 가장 일반적인 형태 결핵 병변, 가래 및 분리 기관지의 다른 유형을 고려 연구를위한 기초 자료 : 에어로졸 흡입 후의 상부 호흡기 분비물 : 기관지 세척을; 기관지 폐포 린스; 기관지 내시경 검사, 기관 내 및 폐내 생검에서 얻은 물질 : 기관지 흡인, 후두 뇌졸중, 삼출물, 상처로 인한 상처 등

환자의 통제 된 자료 수집을 수행하면 연구의 효율성이 높아집니다. 이 목적을 위해 특별 장착 된 방을 할당하거나 특별 택시를 구입합니다. 물질의 수집은 위험한 절차이므로, 감염성 안전 규칙을 준수하여 연구 자료를 수집해야합니다.

결핵균 검사 용 물질은 환경 오염을 방지하고 수집 된 물질을 오염으로부터 보호하기 위해 단단히 조여진 캡으로 멸균 된 병에 수집됩니다.

진단 물질 수집 용 약병은 다음 요구 사항을 충족해야합니다.

• 내충격 재료로 만들어야합니다.
• 고압 증기 멸균 중에 쉽게 녹아야한다.
• 충분한 양 (40-50 ml)이어야한다.
• 가래 수집을위한 넓은 개구부 (직경 30mm 이상);
• 다루기 쉽고 투명하거나 반투명하므로 뚜껑을 열지 않고 수집 된 샘플의 양과 품질을 평가할 수 있습니다.

최적의 연구 결과를 얻으려면 다음 조건을 준수해야합니다.

• 화학 요법 시작 전에 재료를 수집하십시오.
• 시험 물질은 아침 식사 전에 섭취해야한다.
• 연구를 위해 아침 가래 샘플을 적어도 3 개 수집하는 것이 바람직합니다. 3 일 연속 가래를 모으십시오.
• 수집 된 물질은 가능한 한 빨리 실험실로 보내야합니다.
• 즉시 물질을 실험실에 전달할 수없는 경우에는 48 시간 이하 동안 4 ° C의 공기 온도에서 냉장고에 보관합니다.
• 물질을 운반 할 때는 바이알의 완전성을 면밀히 모니터링해야합니다.

가래가 올바르게 수집 된 경우 점액 또는 점액 성입니다. 시험 한 객담의 최적 부피는 3-5 ml입니다.

Sputum은 의료 전문가의 감독하에 수집됩니다. 가래 수집 책임자는 특정 규칙의 이행을 따라야합니다.

• 환자에게 연구의 목적과 타액이나 비 인두 점액이 아닌 기침의 필요성을 설명 할 필요가 있지만 심부 호흡기의 내용물을 설명해야합니다. 이것은 몇 차례 (2-3 회) 심호흡 한 후에 발생하는 생산적인 기침의 결과로 성취 될 수 있습니다. 구강 내에서 자라는 미생물의 주요 부분과 가래 검사를 방해하는 음식물 잔여 물을 제거하기 위해 환자가 끓인 물로 입을 헹구어 야한다고 환자에게 경고해야합니다.
• 객담 수집에 참여하는 의료 종사자는 목욕 가운과 모자 외에 마스크, 고무 장갑 및 고무 앞치마를 착용해야합니다.
• 환자 뒤에 서, 그의 입술에 가능한 한 가깝게 병을 유지하는 것이 좋습니다하고, 따라서 공기의 흐름이 보건 의료 제공자로부터 떨어지게되는 것을 제공 할 필요가로 즉시 그에게 가래 객담을 분리 :
• 가래 수집이 끝나면 의료 종사자는 바이알을 조심스럽게 뚜껑을 닫고 수집 된 가래의 양과 질을 평가해야합니다. 그런 다음 병에 라벨을 붙여 실험실로 운반 할 수 있도록 특수 bix에 넣습니다.

또는 수집 방에 설치된 장비를 사용하여 자극 흡입을 적용 - 환자는 전 초기 그에게 거담제 :. 마시 멜로 (mukaltin), bromhexine, 성 Ambroxol 등의 뿌리의 추출물을 제공하는 데 필요한 자료의 수집의 날에 아침에 가래, 밤을 생성하지 않는 경우 가래. 이 방법으로 수집 된 물질은 보존 대상이 아니므로 수집 일에 검사해야합니다. 실험실에서 "컬링 (culling)"방향을 피하려면 특별한 표시를해야합니다.

미생물 학적 연구가이 시설에서 수행되지 않는다면, 수집 된 진단 물질은 냉장고에서의 전달과 방부제 사용 사이의 간격으로 보존된다면 실험실에 중앙에서 전달되어야합니다. 쉽게 소독 할 수있는 운송용 상자에 재료를 실험실로 운반하십시오. 각 표본에 적절한 라벨이 제공되어야하며 전체 롯트는 첨부 된 양식으로 채워 져야합니다.

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환자의 검사 모드 및 빈도

결핵에 대한 환자의 초기 검사, 소위 진단, 검사에서 2 ~ 3 일 동안 적어도 3 개의 객담을 조사 할 필요가 있습니다. 의료 종사자의 감독하에 수집되어 현미경 검사의 효율성을 높입니다.

결핵에 대한 1 차 심사는 의료 시스템의 모든 의료 진단 기관에서 수행해야합니다. 최근 현대 현미경과 전염병 안전 장비를 갖춘 소위 검안 센터는 초기 진단의 효율성을 높이기 위해 임상 진단 실험실을 기반으로 구성되었습니다.

항 결핵 치료 시설에서 객담 검진이나 다른 진단 물질을 포함하는 스크리닝 검사를 3 일 동안 최소 3 회 실시합니다. 치료 기간 동안, 집중적 인 화학 요법 단계 중에 한 달에 최소 한 번 정기적으로 미생물 연구가 수행됩니다. 치료 단계로 전환 할 때, 연구는 2-3 개월 간격으로 덜 빈번하게 수행되지만 연구의 빈도는 2로 줄어 듭니다.

폐외 결핵 진단 물질 모음의 특징

미생물 연구에 더 민감 방법이 필요 그것에 결핵균 저농도, 주로 시드 기법 매체 - TB의 폐외 형태와 병리 재료가 있습니다.

비뇨 생식기 시스템의 결핵으로 소변은 가장 접근하기 쉬운 학습 자료입니다. 소변 수집은 특별히 숙련 된 간호사가 수행해야합니다.

외부 생식기는 비누 또는 과망간산 칼륨의 약한 용액으로 물로 씻어 낸다. 요도의 외부 개구는 조심스럽게 치료됩니다. 멸균 된 약병에서는 평균적으로 아침에 소변이 수집됩니다 : 남성의 경우 자연적으로 여성의 경우 카테터를 사용합니다. 신장 골반의 소변은 1 ~ 2 개의 신장 도관이있는 멸균 튜브에 모으고 후자의 경우에는 반드시 각 신장과 별도로 채취합니다. 소량의 소변을 원심 분리하여 침전물을 검사합니다.

남자, 정액, 마른 고환에서 전립선의 비밀은 침전물을 얻기 위해 원심 분리를 받게됩니다. 전립선 마사지는 남성의 생식기 부위에서 특정 과정이 국소화되어 있으면 결핵균이 포함 된 분비물의 분비를 촉진시킬 수 있습니다.

여성의 생리혈은 카프카 캡을 빨거나 사용하여 수집합니다. 얻은 물질을 적혈구에서 제거하고 증류수로 세척 한 후 원심 분리합니다. 침전물을 검사한다.

자궁 경부로부터의 할당은 일부 카프카 용량 또는 마개에서 수집됩니다. 즉 병적 인 물질 1-2 ml를 축적하는 것이 바람직합니다.

신장, 생식기의 수술 중재에서 얻은 물질. 생체 검사, 자궁 내막으로부터의 긁기, 균질화. 이렇게하기 위해, 그것은 멸균 모르타르에 배치하고 철저하게 멸균 가위로 짓 눌린. 이 슬러리의 중량에 상당하는 양으로 멸균 강 모래를 첨가 한 후, 0,5-1.0 ml의 등장 성 염화나트륨 용액을 얹어, 모든 것이 등장 성 염화나트륨 용액 (4-5 mL)을 추가하여 페이스트 질량 때까지 분쇄 하였다. 이어서, 매스를 1-1.5 분 동안 침전시키고, 상등액을 검사한다.

뼈와 관절의 결핵. 멸균 주사기로 얻은 점액 (농양 농양)을 무균 식기에 넣고 즉시 실험실에 배달합니다. 멸균 된 등장 성 염화나트륨 용액으로 미리 닦아 낸 멸균 피펫은 고름 2 ~ 5ml를 가지고 구슬 병에 옮기고 다른 2 ~ 3ml의 등장 성 염화 나트륨 용액을 추가한다. 병은 코르크 마개로 막히고 조커 장치로 8-10 분 동안 흔든다. 균질 현탁액을 검사한다.

골관절염의 결절 형태에서 누관의 고름이 잡힙니다. 풍부한 배출물은 시험관에 직접 수집됩니다. 희박한 경우 농루 루 멸균 등장 성 식염수로 세척하고, 세척액은 시험관, 또는 분석을 위해 전송 고름 함침 탐폰의 조각으로 수집 하였다.

수술 재료는 화농성-괴사 대중, 과립, 흉터, 뼈 조직 활액 막 다른 기판으로 구성 될 수있다 뼈와 관절 수술시 획득. 그 치료는 신장의 결핵처럼 수행됩니다.

응고를 방지하기 위해 3 % 구연산 나트륨 용액 (1 : 1 비율)에서 활액을 미생물 학적으로 연구하여 펑크 직후에 실시합니다.

림프절 결핵. 림프절의 뚫린 상태에서 추출한 고름도 검사합니다. 농양의 고름으로. 외과 적 개입 동안 얻은 림프절의 조직, 생검은 다른 형태의 결핵과 마찬가지로 검사됩니다.

결핵균에 대한 대변의 연구는 양성 결과가 거의 없기 때문에 극히 드물다.

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Mycobacterium 현미경 검사

Sputum 현미경 검사는 결핵이 의심되는 모든 경우에 사용해야하는 상대적으로 빠르고 간단하고 저렴한 방법입니다. 또한, 본 연구는 화학 요법의 효과를 평가하고, 배양 검사가 없을 경우 치료의 회복 또는 실패 여부를 확인하기 위해 수행되었다.

현미경 검사의 두 가지 방법이 사용됩니다 :

• 스미어가 진단 물질로부터 직접 제조 될 때 직접 현미경 검사법;
• 배양을 위해 오염 제거제로 처리 된 침전물을 현미경으로 관찰하는 방법.

첫 번째 방법은 현미경 검사 만 수행되는 실험실 (일반 의료 네트워크의 임상 및 진단 실험실)에서 사용됩니다.

현미경 검사의 최상의 결과는 진단 물질을 농축 (예 : 원심 분리)하여 얻어집니다.

현미경 검사를 수행 할 때 50 %의 확률로 결핵균을 검출하기 위해 1 ml의 객담에는 5000 개 이상의 미생물 세포가 있어야합니다. 폐결핵이있는 환자의 객담에는 대개 상당량의 산 - 빠른 박테리아가 포함되어있어 세균 현미경으로 확실하게 검출 할 수 있습니다. 이 방법의 진단 감도는 한 환자의 여러 가래 샘플을 검사하여 향상시킬 수 있습니다. 일부 환자의 객담은 현미경으로 발견 할 수있는 것보다 적은 마이코 박테리아를 포함하기 때문에 세균성 검사의 부정적인 결과는 결핵 진단을 배제하지 않습니다. 객담 도말의 불충분 한 준비는 또한 세균 경 검사의 부정적인 결과를 초래할 수 있습니다.

도말 검사에서 acid-fast mycobacteria를 검출하는 가장 일반적인 방법은 Tsiol-Nelsen에 따른 색상입니다. 이 방법은 페놀의 가열과 강력한 에칭 작용과 동시에 왁스 성 지질 층을 포함하는 멤브레인을 통해 탄산 퓌 신의 미생물 세포로의 침투를 기반으로합니다. 황산 또는 3 % 염산의 25 % 용액으로 도말 한 후 계속해서 변색되면 모든 산성이 아닌 구조가 변색됩니다. 스미어의 변색 된 요소는 메틸렌 블루의 0.3 % 용액으로 염색된다. Mycobacteria는 보통의 아닐린 염료를 인식하지 못합니다. 그 결과 산성 속 미코 박테리아는 진홍색 - 빨강 및 기타 미생물 및 세포 성분이 파란색으로 염색됩니다.

Ziehl-Nelsenu 의해 염색 얼룩 오일 침지 렌즈 (90 ~ 100 배 증가) 및 7- 또는 10 배 배율 접안 빛 쌍안 현미경을 사용한다. 시야에 단일 미코 박테리아를 식별 할 수있는 100 개의 시야를 탐험하십시오. 그러한 연구의 결과가 부정적인 경우, 확인을 위해 또 다른 200 시야를 보는 것이 좋습니다. 검출 된 acid-fast bacilli (KUM)의 수를 나타내는 결과를 기록하십시오.

이 기술 외에도 형광 현미경을 사용하여 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 현미경 검사의 효율이 10-15 % 향상됩니다. 미코 박테리아를 발광 염료 (auramine, rhodamine 등)로 처리 할 때 이들 물질은 미생물 세포의 왁스 유사 구조에도 결합합니다. 흥미로운 광원 (자외선 방사의 특정 스펙트럼)으로 유색 세포를 조사 할 때, 그들은 검은 색 또는 진한 녹색 배경에 주황색 또는 밝은 적색 광선으로 빛나기 시작합니다. 가시 광선의 높은 밝기와 명암 대비로 인해 현미경의 전체 배율을 4 ~ 10 배로 줄일 수 있으며 시야가 넓어지고 준비 시간이 줄어 듭니다. 이와 함께 훨씬 더 깊은 피사계 심도로 인해 연구의 편의성을 높일 수 있습니다.

형광 현미경 검사를 사용하여 동일한 부위를 관찰 할 때, 번짐은 Tsiol-Nelsen 염색의 광학 현미경 검사보다 훨씬 적은 시간을 소비합니다. 근무일의 경우 현미경이 약 20-25 번 정도의 번짐을 검사 한 다음 형광 현미경 검사를 통해 동시에 60-80 개 이상의 샘플을 검사 할 수 있습니다. 숙련 된 현미경 학자들은 auramine과 rhodamine이 혼합 된 세포의 착색이 acid fast bacilli에 특유한 것으로 나타 났는데,이 경우에는 황금색 막대기처럼 보입니다. 부생충은 녹색을 띤 색으로 칠해집니다.

형광 현미경의 방법의 또 다른 중요한 장점 - 변경된 마이 코박 테 리움을 감지 할 수있는 능력은 집중적 인 화학 요법, kislotousotoychivosti 재산이 염색 Ziehl-Nelsenu와 관련하여 감지되지 포함한 불리한 요인의 영향을 잃었다.

형광 현미경 검사법의 단점은 현미경 검사 및 수술 비용이 상대적으로 높다는 점입니다. 그러나 3 개의 기존 현미경으로 작업하는 3 명의 실험 기술자의 표준을 초과하는 중앙 집중식 또는 기타 대형 실험실에서는 대신 하나의 형광 현미경을 사용하는 것이 더 저렴합니다.

세균 검사법은 매우 높은 특이성 (89-100 %)을 가지고 있습니다. 현미경 검사법으로 얻은 양성 결과의 약 97 %는 파종 결과에 의해 확실하게 확인됩니다.

병리학 적 물질의 번짐을 현미경으로 검사 할 때, 확인 된 산 - 빠른 마이 코박 테 리움 속의 종을 결정하는 것은 불가능하다는 점에 유의해야합니다. 현미경 방식은 복잡한 결핵성 항산 균 nontubercular 내산성 미생물에 형태 학적으로 유사한 다수의 자연에서 존재에 의해 설명 될 수있는 미생물의 제조에서 산의 존재 또는 부재에 대한 의견을 제공 할 수있다.

현미경 검사의 결과는 반 정량적 단위로 평가됩니다.

상이한 현미경 검사법의 결과를 비교할 수 있도록 경험적 계수가 소개됩니다. 예를 들면, 형광 염료로 염색 얼룩의 결과를 비교하는 데이터 조사 광 현미경 (1000 배 확대)는 형광 현미경에 의해 검출 된 항산 균의 수를 분할 할 필요가 있고, 250 배의 배율에 대응하는 계수 - 10, 450 배 ~ 4 배, 630 배 ~ 2 배.

폐외 결핵에 대한 현미경 검사의 특징

직접 현미경 검사뿐만 아니라 농축 후 준비한 도말의 현미경 검사,이어서 Tsiol-Nelsen 염색 또는 발광 염료가 수행됩니다. 도말의 직접 현미경 검사는 재료 내 미코 박테리아의 농도가 낮기 때문에 효과적이지 않으므로 농축 방법을 사용하는 것이 더 합리적입니다. 가장 효과적인 것은 원심 분리입니다. 생물학적 물질이 점성을 띠는 경우 원심 분리는 3000 g의 원심력과 차아 염소산염 용액으로 고속 원심 분리기를 사용하여 동시에 물질의 균질화 및 액화를 사용합니다. 미세 부유와 같은 농축의 다른 방법은 현재 생물학적으로 위험한 에어로졸의 형성 때문에 사용되지 않습니다.

[37], [38],

결핵 진단의 문화적 방법

파종 방법 또는 배양 방법은 스미어 현미경보다 민감하며, 후자에 비해 많은 이점이 있습니다. 시험 물질에서 수십 가지의 생존 가능한 마이코 박테리아를 검출 할 수 있으며 진단 가치가 뛰어납니다. 이는 소량의 마이코 박테리아를 방출하는 새로 진단되거나 치료 된 환자의 물질을 검사 할 때 특히 중요합니다.

현미경 검사와 비교하여 문화 연구를 통해 15-25 % 이상 진단 된 결핵 환자 수를 늘릴 수있을뿐 아니라 치료 초기에도 결핵을 확인할 수 있습니다. 배양 검사의 매우 중요한 이점은 약물 감수성, 병독성 및 기타 생물학적 특성과 관련하여 확인 및 연구 할 수있는 자극기 배양 균을 얻을 수 있다는 것입니다.

재배 방법의 단점은 기간 (재료의 대기 시간이 10 주에 이른다)이다. 높은 비용, 진단 물질의 처리 복잡성.

진단 물질의 선행 치료 원칙

기존의 미생물 학적 방법은 결핵 연구를 수행하는 데 사용할 수 없습니다. 이것은 사실 때문입니다. 결핵균이 매우 천천히 자라며 대부분의 임상 표본에는 빨리 자라는 화농성 및 부패성 미생물 인 곰팡이가 들어 있습니다. 풍부한 양분 배지에서의 급속한 성장은 마이 코박 테 리움의 발달을 방해하고 결핵의 원인 물질을 분리하지 못하게하므로 씨앗을 뿌리기 전에 진단 물질을 사전에 처리해야합니다. 또한 환자의기도에서 방출 된 마이코 박테리아는 대개 많은 양의 점액으로 둘러싸여있어 집중하기가 어렵습니다. 이와 관련하여, 가래 및 기타 유사한 물질을 심기 전에, 그들의 액화, 오염물 제거가 필요합니다.

모든 세제 및 제독 약은 마이코 박테리아에 대해 거의 확실한 독성 영향을 미칩니다. 가공 결과, 마이코 박테리아의 최대 90 %가 사망 할 수 있습니다. 재료에 존재하는 마이코 박테리아의 생존을 유지하기 위해 - 빠르게 성장하는 화농성 세균과 부패를 억제하고, 다른 한편에, 한 손에 수 처리 기술을 사용할 필요를 살려주는 마이코 박테리아 인구의 정도를 유지합니다.

4 %의 수산화 나트륨 수용액, 액제가 인산 나트륨 10 %, 벤즈 알 코늄 클로라이드, 트리 소듐 포스페이트, NALC-NaOH로를 trohzameschonnogo (N- 아세틸 -L- 시스테인 - 객담 : 재료, 각종 오염 제거제를 사용하여 사전 처리 균일 성 및 오염의 정도에 따라 황산을 3 %, 오염 된 시료, 지방 - 함유 물질 - - 5 % 옥살산 용액 뇨 및 기타 액체 물질을 1 %의 NaOH의 최종 농도에서 수산화 나트륨). 또한, 경우에 따라 효소, 계면 활성제 (세제)가 사용됩니다. 응용 프로그램 트윈 세제 및 다른 마이코 박테리아 사망 (40~50% 생존) 덜 세포를 동반한다. 그러나 액체 소재에만 사용할 수 있습니다. 세계에서 가장 큰 분포는 NALC-NaOH입니다. 세트로 생산됩니다. 이 방법은 마이코 박테리아 세포 집단의 85 % 이상을 할당 할 수 있습니다. 어렵게 제염 tkanesoderzhaschih 고형분 인해 균질화 동안 물질의 분산도 어려운 추측. 예를 들어, 림프절의 치료 생검은 종종 외부 식물 오염의 빈도 증가를 동반한다. 이 경우 1 %의 에텔 늄을 사용할 수 있습니다.

불균일 한 물질은 오염 제거제가있는 유리 구슬로 균질화됩니다. 액체 물질은 예비 원심 분리되고 침전물 만 처리됩니다.

파종 및 배양 기술

전처리 후 물질을 원심 분리하여 미코 박테리아를 침전시키고 침전물의 함량을 증가시킵니다 ( "슬러지 농축"). 생성 된 침전물을 중화시키고 조밀 한 영양 배지 또는 액체 (반 액체) 배지를 갖는 튜브로 접종 (접종)한다. 나머지 침전물로부터 도말 검사는 현미경 검사를 위해 준비됩니다. 파종 기술은 진단 물질의 교차 오염을 방지해야합니다.

미생물 연구의 결과에 대한 신뢰할 수있는 임상 적 해석을 위해서는 다음과 같은 규칙을 준수해야합니다. 현미경 검사 및 배양 검사는 동일한 진단 시료 샘플과 병행하여 수행해야합니다.

접종 된 튜브를 온도 조절기에 넣고 37 ^° C에서 2 일간 수평 위치에 둔다 . 이는 배양 배지로 물질을보다 균일하게 흡수하는 것을 보장합니다. 2 일 후 튜브를 수직 위치로 옮기고 고무 또는 실리콘 플러그로 기밀 밀봉하여 파우더를 건조시키는 것을 방지합니다.

작물은 37에서 배양되는 ^대해 정기적으로 매주 시청 10-12 주 동안 C. 각 미리보기에서 다음 매개 변수가 기록됩니다.

• 파종하는 날로부터 시각적으로 관찰 된 기간;
• 성장률 (CFU 수);
• 외부 식물 또는 곰팡이에 의한 작물의 오염 (그러한 관은 제거됨);
• 보이는 성장의 부족. 튜브는 다음 온도가 될 때까지 온도 조절 장치에 남아 있습니다.

양분 매체

마이 코 박테리아의 배양에는 다양한 영양 배지가 사용됩니다. 고밀도, 반 액체, 액체. 그러나 알려진 영양 매체 중에는 모든 마이코 박테리아 세포의 성장을 보장하는 특성이 없습니다. 이와 관련하여 2-3 가지 영양소 배지를 동시에 사용하여 효과를 높이는 것이 좋습니다.

WHO는 Levenstein-Jensen 환경을 결핵의 원인균의 일차적 인 분리 및 약물 감수성의 결정을위한 표준 배지로 추천한다. 이것은 세균 현미경으로 양성인 물질을 파종 한 후 20-25 일에 마이코 박테리아의 성장이 얻어지는 조밀 한 알의 환경입니다. 세균 경구 용 물질의 작물은 더 긴 잠복기 (10-12 주까지)가 필요합니다.

우리 나라에서는 제안 된 E.R. 핀 계란 환경 Finn-II. L- 아스파라긴 대신에 글루탐산 나트륨을 사용하여 마이 코박 테 리움의 아미노산을 합성하는 다른 방법을 유발합니다. 성장은 다소 일찍이 매체에 나타나고, 마이코 박테리아의 할당 빈도는 Lowenstein-Jensen 배지에서보다 6-8 % 더 높습니다.

폐 결핵에 대한 세균 학적 진단의 효과를 높이려면 영양소 복합체에 변형 된 Finn-II 배지를 포함시키는 것이 좋습니다. 성장을 촉진시키기 위해 산소 농도를 낮추는 0.05 % 나트륨 티오 글리콜 레이트를 추가로 Finn-II 영양 배지에 첨가합니다. Finn-II 영양 배지에서 지질 과산화의 독성 생성물로부터 마이코 박테리아의 효소 시스템을 보호하기 위해 산화 방지제 α- 토코페롤 아세테이트를 0.001 μg / ml의 농도로 첨가합니다. 진단 물질의 파종은 표준 절차에 따라 수행된다.

러시아의 결핵 연구실에서는 밀도가 높은 영양 배지의 다른 변형도 사용됩니다. G.G. V.A.에 의해 개발 된 모르도비 영양 배지 "New". Anicic 영양 배지 A-6 및 A-9 등

때문에 화학 요법의 과정에서 미생물 세포의 다양한 대사 시스템에 손상이라는 사실에, 일부 마이코 박테리아 인구는 기존의 영양 배지에서 일반적으로 개발하는 능력을 잃고 삼투압 균형 (또는 반 액체) 문화 매체가 필요합니다.

진단 물질의 파종 결과 평가 및 기록

일부 균주 및 종의 마이 코박 테 리움이 서서히 자라며 성장은 90 일째까지 나타날 수 있습니다. 그러한 작물의 수는 적지 만, 이것은 2.5-3 개월 동안 항온조에서 작물을 견딜 수있게합니다.

미코 박테 리움 결핵균은 일반적으로 다양한 크기와 종의 R- 형태 콜로니의 형태로 치밀한 난 환경에서 자라납니다. 식민지는 건조하고, 주름지고, 상아색이 약간 색이 나타납니다. 다른 매개체에서 결핵균은 더 습기가있을 수 있습니다. 화학 요법의 과정이나 치료 중, 축축한 성장 (S-forms)을 가진 부드러운 콜로니를 할당 할 수 있습니다.

작물을 분리 할 때, 특수 연구 세트는 결핵균과 결핵균을 구분하고 미생물 성 결핵균과 내산성 부생 균을 구별하기 위해 사용됩니다.

성장한 콜로니에서 염색 된 티올 - 넬슨 번짐을 의무적으로 현미경으로 검사 한 후 긍정적 인 반응이 나타납니다. 얼룩이있는 미코 박테리아의 성장의 경우, 딱딱한 빨강 스틱이 단독으로 또는 펠트 또는 끈의 형태로 클러스터를 형성하는 그룹으로 발견됩니다. 특히 화학 요법 환자의 장기 치료에서 분리 젊은 문화에서 마이코 박테리아가 존재까지 균사체 유사한 짧은 또는 긴 거의 coccoid 버전과 함께 봉상, 발현 된 다형성 다르다.

마이코 박테리아의 성장률은 다음과 같은 계획에 의해 표시됩니다 : (+) - 체외 (단점 박테리아 배설)에 1-20 cfu; (++) - 시험관 내 20-100 CFU (중등도 박테리아 배설); (+++) -> 100 CFU in vitro (풍부한 박테리아 배설). 결핵에 대한 실험실 진단에서 mycobacterium이 하나 또는 다른 방법으로 검출되는지 여부에 대한 대답은 충분하지 않습니다. 미코 박테리아 개체군의 범위와 특성, 구성 및 특성에 대한 자세한 이해 우리가 프로세스의 상태를 정확하게 해석하고 전략을 수립하며시의 적절하게 치료할 수있게하는 것은 이러한 데이터입니다.

최근에는 마이코 박테리아의 성장을 촉진하기 위해 여러 가지 성장 첨가제와 함께 한천 배지의 영양 배지 및 특수 가스 혼합물의 사용이 제안되었습니다. 이 배지에서 마이코 박테리아의 성장을 얻으려면 재배 중에 4-7 %의 이산화탄소 함량이 높은 대기가 만들어집니다. 이 목적을 위해 특별한 CO ₂ 인큐베이터 가 사용됩니다 . 그러나 MGIT-BACTEC-960 및 MB / Bact와 같이 가장 많이 개발 된 마이코 박테리아 자동화 시스템은 다음과 같습니다.

이러한 하나의 시스템 - MGIT 시스템 (마이코 박테리아 성장 표시 관), 첨단 기술의 발전을 참조하여 일차 약물 및 일부 두번째 선 약물 결핵 결핵균의 감수성의 신속한 세균 진단을 위해 의도된다. MGIT는 VASTES-960 장치의 일부로이를 사용하는 데 중점을두고 있습니다. 미생물은 수정 된 Middlebrook-7H9 배지를 기본으로하는 액체 영양 배지가있는 특수 튜브에서 재배됩니다. 마이코 박테리아의 성장을 자극하고 외래 미생물의 번식을 억제하기 위해 MGIT Growth Supplement와 PANTA 항균제가 혼합되어 사용됩니다.

미생물의 성장은 광학적으로 기록됩니다. 그것은 성장을하는 동안 마이코 박테리아가 산소를 소비 할 때 발생하는 형광을 기반으로합니다. 산소 의존형 형광 색소 염료는 특수 시험관 바닥에 있으며 실리콘 층으로 덮여 있습니다. 생식 마이코 박테리아는 튜브의 산소의 양이 감소하고, 자외선 튜브에 의해 조사시 표시되고 자동 등록 광 센서 내장 기기 VASTES-960 형광의 증가를 야기하는 농도의 감소에 이르게. 발광 강도는 성장 단위 (GU- 성장 단위)로 기록됩니다. 성장 데이터는 컴퓨터에 기록되어 자동으로 저장할 수 있습니다. 성장 곡선의 컴퓨터 분석은 비 결핵을 비롯한 다양한 마이코 박테리아 풀에 대한 정보를 제공 할 수 있으며 또한 마이코 박테리아의 성장 특성을 평가하는 데 도움이됩니다.

이러한 시스템의 도입으로 마이코 박테리아의 성장 시간은 VASTES-960에서 11 일 평균, MB / Bact에서 19 일, 표준 고밀도 영양 배지에서 33 일 평균으로 현저히 감소했습니다. 이러한 시스템에는 우수한 인력이 필요하다는 점에 유의해야합니다. 액체 미디어 시드 재료는 Lowenstein-Jensen이 매체에 파종 결핵균의 다른 미디어의 성장을 허용하지 않는 경우 경우에 대역 배우의 역할을 호위한다.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

마이코 박테리아의 약물 감도 측정

항결핵제에 대한 마이코 박테리아의 민감도와 스펙트럼의 결정은 임상 적으로 중요하며 약물 내성이있는 결핵 확산의 역학 평가에도 유용합니다. 또한 약물 내성을 모니터링하면 결핵 프로그램 전체의 효과를 평가할 수있어 결핵 퇴치 활동의 모든 구성 요소의 성과를 나타내는 필수 지표가됩니다.

약물 감수성의 다중성 및 타이밍 :

• 치료의 전략과 전술을 결정하기 위해 치료 시작 전 :
• 다양한 물질 (가래, BAL 액, 소변, 삼출액, 주류 등)에서 질병이있는 배양 물로부터 격리 될 때, 모든 분리 된 균주가 검사됩니다 :
• 임상 및 방사선 역학이없는 집중 치료 단계가 끝날 때 :
• 다음과 같은 경우 치료법을 변경해야하는 경우 :
  • 객담 도말의 부재;
  • 객담 도말 후 음성 배양 후 재조합;
  • 초기 감소 이후 면봉의 CMB 수가 급격히 증가했습니다. 결핵 환자는 약제 감수성 측면에서 이질성 인 결핵 균주가 격리되어 있다는 사실은 잘 알려져 있습니다. 항 결핵 약물에 대한 변종 민감성은 약물, 정도, 빈도 및 저항 발생률의 범위에서 다를 수 있습니다.

결핵균의 약제 내성의 정도는 항 TB 약물의 약동학, 병변의 농도의 활성에 의존하는 임상 적 중요성과 안정성에 집중 설정된 기준에 따라서 결정 하였다. 최대 치료 용량 등등.

마이코 박테리아의 약물 감도 측정은 현재 미생물 학적 방법으로 수행됩니다 :

• 절대 농도 (농축 또는 액상 영양 매체의 희석 방법),
• 비율,
• 저항 계수.

일반적으로 안정성은 결핵균의 육안 관찰 콜로니로 성장 발현하지만, 색 반응의 형태 결핵균 세포 분할 성장의 초기 단계를 유도하는 기술이있다. 이 방법은 테스트 시간을 3-4 주에서 2 주로 단축합니다.

러시아에서 통합으로,보기의 방법 론적 관점에서입니다 절대 농도의 WHO위원회 화학 요법 방법, 추천, 확장 가장 간단하지만 높은 정밀도와 실험 절차의 표준화를 요구하고있다. DST는 영양 배지, 수정 항 결핵 약물과 튜브의 집합으로 이루어져있다. 세트 2-3 환경 약물없이 다른 사용 된 약물의 각 농도는, 하나의 제어 튜브와 튜브 및 하나 개의 튜브는 마이코 박테리아의 성장을 검출 나트륨 살리의 tsilovokislogo 500 UG / ㎖ paranitrobenzoynoy 산 nontubercular 1000 MCG / ㎖를 함유하는 구성.

준비가 된 배지 세트를 준비하기 위해 변형 된 Levenstein-Jensen 배지 (전분을 사용하지 않음)를 사용하여 플라스크에 붓습니다. 각 플라스크에는 항균제의 적절한 희석 배지가 첨가됩니다. 플라스크의 내용물을 완전히 혼합하고, 튜브에 붓고, 85 ℃의 온도에서 40 분 동안 경 사진 위치에서 접는다. 자동 온도 조절 기능이있는 전기 되감기 장치에 매체를 감을 것을 권장합니다. 수요일, 항 결핵약으로

1 차 시리즈는 2-4 ° C에서 1 개월 동안 냉장고에 보관할 수 있으며 두 번째 줄은 2 주 이상 준비 할 수 있습니다. 상온에서 조제 된 매체를 보관하는 것은 용납되지 않습니다. 항결핵제 용액을 제조 할 때, 그 활성을 고려하여 농도를 계산하고 비특이적 인 부분의 분자량, 순도 등을 보정한다. 약물 감도를 결정하기 위해 화학적으로 순수한 물질 만 사용됩니다.

이 방법의 원리는 미코 박테리아 개체군의 상당 부분의 성장을 억제하는 항결핵제의 농도를 결정하는 것입니다. 올바르게 수행되면이 방법은 좋은 신뢰성을 갖습니다.

검사 전에 미코 박테리아 결핵 배양 균에 외래 미생물이 없는지 확인해야합니다. 0.9 % 염화나트륨 용액 중의 마이 코박 테 리움 배양 물로부터 1ml 당 5 억 미생물 체를 포함하는 균질 현탁액을 제조한다 (광학 혼탁도 표준 5 단위). 생성 된 슬러리를 0.9 % 염화나트륨 용액 (1:10)으로 희석하고 0.2 ㎖의 슬러리를 배양 배지 세트의 각 튜브에 첨가 하였다. 시딩 된 튜브를 37 ℃의 항온조에 놓고 2 ~ 3 일 동안 수평으로 유지하여 배양 배지의 경사 표면이 결핵균의 현탁액을 균일하게 접종하도록합니다. 튜브를 수직 위치로 옮기고 3-4 주 동안 배양합니다. 결과는 3-4 주 후에 기록됩니다.

영양 물질 배양액에서 배설되는 배설물의 배설시기는 적어도 1-1.5 개월이므로이 방법으로 약물 감수성을 측정 한 결과는 배양 후 2-2.5 개월 이내에 얻을 수있다. 이것은 메소드의 주요 단점 중 하나입니다.

특정 기준에 근거하여 마이코 박테리아의 약물 감도를 결정한 결과를 해석하십시오. 이 약물 시험 관내에서 성장 마이코 박테리아의 콜로니의 개수가 약없이 제어 튜브 풍부한 성장하지 20 이상이면 고체 배지에 배지에 포함 된 약물의 농도에 민감하게된다. 20 개 이상의 콜로니가있는 환경에서만 배양이이 농도에 저항성이있는 것으로 간주됩니다. 실제로, 20 cfu에 가까운 시험관에서 성장을 얻는 경우. 임상 지표에 민감성이나 저항성이 경계선이라는 사실을 임상 단위에 알릴 필요가 있습니다. 때로는 임상 지표의 퍼지 역학을 설명 할 수 있기 때문입니다.

여러 가지 약물의 경우, 특정 농도가 확립되어 미코 박테리아 개체군의 중요한 비율의 번식이 관찰됩니다. 이러한 농도를 "임계"라고합니다. 안정성의 기준으로서, 임계 농도의 제제를 함유 한 영양 배지상의 마이코 박테리아 집단의 성장이 이용된다.

국내 결핵 진료에서는 약물 내성을 결정할 때 임계 농도 만 결정하는 데 그치지 않습니다. 이것은 사실 때문입니다. 약물 내성의 확장 정의 수준은 임상 더 정확하게, 약물 조합의 작용을 증강의 지식을 사용하여 전술 화학 요법의 위치를 예상 저항을 십자 또는보다 효과적인 약물 그룹이 항 결핵 약물을 사용 적용 할 수 있다는 것.

절대 농도 방법은 가장 단순하지만 수행 할 때 발생하는 오류에 가장 민감합니다. 특히 제 2의 약제에 대한 민감성을 결정할 때 더욱 신뢰할 수 있으며, 러시아 이외의 일반적인 방법은 비율의 방법입니다. 그것은 절대 농도의 방법의 단점을 고려하지만, 실행에는 더 힘들다.

이 방법은 절대 농도 방법과 매우 유사합니다. 의약품을 포함한 시험관의 제조는 같은 방법으로 수행됩니다. 절대 농도 법 에서처럼. 그러나, 결핵균의 종결 량은 10 배로 감소합니다. (Etambutol), 프로피온 아미드 (propionamide), 카프 레오 마이신 (capreomycin)과 같은 약물에 대한 자궁 경부 결핵 (mycobacterium tuberculosis)의 자발적인 내성의 빈도를 제거합니다. 대조군으로, 시험관에서 동등한 종자 투여 량을 갖는 2 개 또는 3 개의 튜브가 연속적으로 10 배 및 100 배 희석되어 사용된다. 안정성의 기준은 시각적으로 관찰 된 결핵균의 성장률의 비율입니다. 첫 번째 시리즈의 약물의 경우, 안정성 기준은 두 번째 행의 약물에 대해 초기 인구의 1 %의 성장 초과 - 선택된 임계 농도에 따라 초기의 1 % 또는 10 % 증가.

1997 년, 좋은 결핵 결핵 약제 내성의 식별을 위해 WHO와 국제 연합의 작업 그룹은 다음과 같은 농도에서 고체 계란 미디어 Lowenstein-Jensen이 성장할 것으로 간주 내성 결핵균을 제공하고, 이러한 기준을 조정했다 :

• 디 하이드로 스트렙토 마이신 - 4 ㎍ / ml;
• 이소니아지드 0.2 μg / ml :
• 리팜피신 40 ㎍ / ml :
• 에탐부톨 - 2 μg / ml.

2001 년에 다음과 같은 2 차 약제에 대해 임계 농도가 제안되었다 (1 %의 임계 비율) :

• 카프 레오 마이신 - 40 mcg / ml;
• 프로피온 아미드 - 40 mcg / ml;
• 카나마이신 - 30㎍ / ml;
• 바이 오신 - 30 mcg / ml;
• 사이클로 세린 40 ㎍ / ml;
• 아미노 살리실산 - 0.5㎍ / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

성장 결과는 4 주간 예비 및 6 주간의 재배 후에 최종 결과로 평가됩니다.

결핵에 대한 현대 화학 요법에서 널리 사용되는 pyrazinamide에 대한 약물 감도를 결정하기 위해 권장되는 임계 농도는 200 μg / ml입니다. 그러나 지금까지는 항균 활성이 기술적으로 유지하기 어려운 산성 매질 (pH <6)에서만 나타 났으므로, 고체 영양물 배지에서이 약물에 대한 약제 내성을 결정하는 일반적으로 인정되는 방법은 없습니다. 또한 결핵균의 많은 임상 배양은 산성 환경을 가진 난 환경에서 마지 못해 자랍니다.

마이코 박테리아의 약물 감수성을 결정한 결과의 질을 평가하기 위해 Levenstein-Jensen 배지의 새로운 배치를 표준 박물관 균주 H37Rv의 감도를 병렬로 측정하여 모니터링하는 것이 좋습니다. 또한 기술을 잘 재현하고 올바르게 해석 할 수 있도록 유지되어야하는 특정 미생물 학적 기준이 있습니다. 이러한 결핵균 배양 가능성을 포함하는, 결핵균, 선택된 균체의 대표성 선택 규칙의 균질 현탁액을 현탁 배양 물을 얻기위한 규칙. 극히 드물게 박테리아가 방출되면 약물 내성 측정의 신뢰성이 떨어집니다.

최근에는 자동화 시스템을 이용하여 약물 감수성을 측정하는 방법이 기대되고있다. 이 분야에서 가장 완벽한 것은 VASTES MGIT-960을 기반으로 한 개발입니다. 이 경우, 결핵균의 약물 감수성은 변형 된 방법의 비율에 따라 결정됩니다. 결 정 과정에서 대조 관과 약물이 들어있는 시험관에서 마이 코박 테 리움 튜 버쿨 로시스 (mycobacterium tuberculosis)의 성장률을 비교합니다. 스트렙토 마이신, isoniazid, rifamp-picin 및 ethambutol에 대한 민감도를 결정하기 위해 SIRE 키트에 포함 된 농축 보충제 및 항생제를 사용합니다. 피라진 아미드에 대한 민감도를 결정하려면 PZA 키트를 사용하십시오. 현탁액을 10 배 희석이고 100 배 피라진 제외한 모든 약물에 대한 재구성 된 현탁액과 현탁액 시험 결핵균 접종 약물 테스트 튜브뿐만 아니라 제어 튜브 과정에서. 안정성 기준은 마이코 박테리아 성장 표시기 값 (100) GU 때 제어 튜브 (400) GU (cm. "마이코 박테리아 분리 방법의 배양")의 성장. 결과의 회계 및 해석은 자동으로 수행되며 입력 또는 선택된 프로그램에 의해 설정됩니다.

임계 농도로서 최종 농도는 액체 영양물 배지가있는 시험관에서 사용됩니다. 현재, 1 차 및 2 차 약물 모두에 대해 중요한 농도가 개발되었습니다. Cycloserine과 aminosalicylic acid에 대한 결핵균 감수성은 난 영양 배지에서만 결정된다는 점에 유의해야한다.

정교한 작업 프로토콜 기술 시스템은 전용 문화 (조밀 한 영양 배지), 체외의 기본 진균 MGIT 성장을 사용하는 등 마약 감도를 연구 할 수 있습니다. 것이 가능 전통적인 방법은 3 개월 얻는 반면, 후자는 크게, 당신은 재료의 수집 일 3 주 후 (약 감도에 대한 정보를 포함) 결핵균의 문화의 전체 결과를 얻을 수 있도록 문화에 대한 시간을 줄일 수 있습니다. 환자가 집중적 인 치료 단계에있을 때 얻어진 결과는 상대적으로 높은 연구 비용을 보충 할 수 있습니다.

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마이코 박테리아의 분화

사용 된 영양물 배지가 엄격하게 선택성이있는 것은 아닙니다. 분리 된 마이 코박 테 리움의 차별화는 강제적 인 것으로 인식됩니다. 마이코 박테리아의 차별화의 필요성으로 인해 속으로 인한 병리 과정의 여러 기능이다 : 다른 코스와 결핵 및 mycobacteriosis의 결과, 일부 항 결핵 약물 천연 약물 내성의 존재.

결핵균 복합체 M.의 nontubercular 마이코 박테리아로부터 기본 식별은 다음과 같은 특징에 의해 수행되는 것으로 인식된다 : 고체 영양 배지, 색소, 콜로니 형태, 내산성 및 온도 최적 성장의 존재에 대한 성장 속도.

불행히도, 확실 M. 다른 항산 균에서 복잡한 결핵균 결핵 차별화 단일 실험실 방법 없다 생화학 검사의 숫자의 아래의 결과와 전술 한 기능 역시 조합 M. 함께 결핵균 복합체 가능성의 식별을 허용 95 %.

다음과 같은 증상의 존재를 감지 nontubercular 기본적인 생화학 적 검사를 사용 느린 성장 마이코 박테리아에서 결핵균 복잡한 M. 결핵의 분화 (M. 결핵, 우형 결핵균, M. BovisBCG, M. Africanum, M.의 microti, M.의 canettii 등)의 경우 :

• 니코틴산 생산 능력 (니아신 시험) :
• 질산 환원 효소 활성;
• 열 안정성 카탈라아제;
• 살리실산 나트륨 (1 mg / ml)을 함유 한 배지에서 성장시켰다.

추가 시험으로서, 500㎍ / ㎖의 파라 니트로 벤조산 또는 5 % 염화나트륨을 함유하는 배지에서의 성장을 또한 사용할 수있다.

많은 세균학 실험실은 실험실의 기능이 제한되어 있고 전문가의 방법 론적 기능으로 인해 단지 미생물 수준에서만 이러한 미생물을 확인합니다.

그러나 대부분의 경우, 결핵균 및 M.의 우형 분화 용 실제로 다음 시험에 충분하다 : 함유 배지에서 질산의 존재 유무 등록 및 pirazinamidazy 성장, 니아신 2 UG / ㎖ 하이 드라 지드 티 오펜 -2- 카복실산. 마이 코박 테 리움 튜 버쿨 로시스 복합체의 마이코 박테리아는 다음과 같은 특징이 있습니다 :

• 느린 성장 (3 주 이상);
• 35-37 범위의 성장 온도 ^입출력 C;
• 착색의 부재 (아이보리);
• 표시된 산 - 빠른 색상;
• 양성 니아신 검사;
• 양성 질산 환원 효소 검사;
• 열 안정성 카탈라아제의 부재 (68 ^℃ ).
• Levenstein-Jensen 배지에서의 성장 부재 :
  • 1000 ㎍ / ㎖ 살리실산 나트륨,
  • 파라 니트로 벤조산 500 ㎍ / ㎖,
  • 5 % 염화나트륨 :
• 1-5 μg / ml 티 오펜 -2- 카르 복실 산의 존재 하에서의 성장.

분리 된 마이 코박 테 리움의 분화의 관련성은 결핵 또는 마이코 박테리아와 관련된 HIV / AIDS 사례 기록 빈도의 증가와 함께 현저하게 증가 할 것입니다. 현재이 작업량을 올바르게 수행하기위한 실용적인 지역 실험실의 준비가 절대적으로 확실하지는 않습니다.

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결핵에 대한 면역 학적 진단

원래 결핵으로 정확하게 발견 된 보편적 인 현상, 마약 및 면역 검사 또는 마이코 박테리아에 대한 면역 반응의 모델이 있습니다. (- Pirquet 및 망투 투베르쿨린 반응), 피하 투베르쿨린 감응 동물 반응 (코흐 현상) 이러한 BCG 결핵, DTH 피부와 같은 현상을 포함한다. 전염성 질병에있는 첫번째 항체의 한개는 또한 결핵에서 검출되었다. 물론, 좋은 결핵 면역 메커니즘의 이해와 자신의 유전자 제어 깊은, 더 큰 TB의 실질적인 문제를 해결하기 위해 면역 체계에 영향을 미치는 면역 학적 방법과 약물의 사용을 수 있습니다.

가장 중요하고 어려운 실용적인 문제는 현재 집단의 대량 선별 과정에서 결핵의 탐지로 간주됩니다. 그러나 제한된 물질에 대한 "성공"에 대한 수많은보고에도 불구하고 적절한 면역 학적 방법 ( "모든 팔"에서 재현 가능) 및이 목적에 적합한 약물은 없습니다.

면역 학적 방법, 특히 혈청 학적 연구 (항원, 항체의 측정) 및 투베르쿨린 유발 검사는 임상 실무에서 매우 널리 사용됩니다.

감별 진단에 사용되는 면역학 연구 중 첫 번째로 혈청 학적 방법, 즉 신체의 다른 환경에서 항원과 항체를 결정하는 방법이 있습니다.

마이코 박테리아 결핵에 대한 항체의 특이성은 면역 측정법에 사용 된 항원에 따라 다릅니다. 상당한 양의 항원이 제안되며, 그 중 가장 첫 번째는 투베르쿨린 PPD입니다 :

• 배양액으로부터의 PAP 및 다른 복합 제제;
• 초음파 붕괴;
• 트리톤 추출물 및 세포벽의 다른 복합 제제;
• 5 항원 (다니엘);
• 60 항원 (코티 토);
• 리포 아라 비노 만난;
• 코드 인자 (트레 할로 오스 -6,6- 디 - 미코 레이트);
• 페놀 및 다른 당지질;
• 지질 다당류;
• 피브로넥틴 결합 항원;
• 단백질 (가장 자주 재조합); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA 등

더 복잡한 항원, 높은 감도와 시험의 낮은 특이성 : 러시아와 외국 과학자들이 수년간의 연구의 결과로 기본 법률과 결핵 항체 혈청 학적 진단의 효율성을 계시했다. 다른 나라의 특이성은 결핵균 감염과 BCG 예방 접종 등을 실시하는 nontubercular 마이코 박테리아의 인구에 따라 달라집니다. 아이들에서 serodiagnosis의 정보 내용이 성인에 비해 낮다. 1 차 결핵 (더 자주 어린이)에서는 IgM의 정의가보다 유익합니다. 2 차 IgG와 HIV에 감염된 환자의 항체 측정에서 혈청 진단의 유익한 가치는 감소합니다. 항체 효율 판정 "임상 양상"의 수에 따라 결정 프로세스 활성 (존재 또는 공동의 "분리"마이코 존재 붕괴 침윤 정도의 유무), 처리의 빈도, 그 흐름의 기간.

효소 면역법 (ELISA) 방법의 민감도는 약 70 %입니다. 이 연구의 불충분 한 효과는 특이성이 낮기 때문입니다. 이전에는 고위험군, 특히 폐 결핵 환자에서 혈청 검사를 사용할 가능성이 고려되었습니다.

ELISA의 특이성을 높이기 위해 유전 공학 (ESAT-6 등)에서 얻은 것을 포함하여 더 구체적인 항원에 대한 검색이 계속됩니다. 엄격히 특정 항원 (38 kDa, ESAT)의 사용은 특이성을 증가시킵니다. 분석의 민감도를 상당히 감소시킵니다. IFA (실험 실험실 테스트 시스템. 일예 Pathozyme ELISA 키트)와 함께 또한 횡 면역 크로마토 그래피 여과 (Mycodot)뿐만 아니라 테스트 결과를 시각적으로 평가와 다른 유사한 실험 (막에 점 분석)을 가진 키트를 제공한다. 이러한 테스트 동안 분석은 10-30 분 동안 수행됩니다. 그들은 특별한 장비를 필요로하지 않는다, 그들은 특정 주관과 관련된 결과의 시각적 평가를 요구한다. 이 방법은 전통적인 ELISA와 거의 동일한 민감도와 특이성 (각각 70 %와 90-93 %)을 나타냅니다.

면역 분석법의 사용은 결핵의 감별 진단, 특히 비 폐동맥 형태의 진단에서 사용 된 방법의 복합체에서 고려 된 부가 가치로서 명확한 가치가있다. 가장 효과적인 ELISA 방법은 뇌척수액 연구에서 결핵성 수막염의 진단에 있습니다. 이 경우 분석 민감도는 80-85 %이고 특이도는 97-98 %입니다. 결핵 포도막염의 진단에서 눈물샘에서 결핵균에 대한 항체 검출의 효과에 대한 자료가 있습니다.

생체 외 감마 인터페론 합성 유도

감마 인터페론 (IFN-γ)은 대 식세포 효소 시스템을 활성화시킴으로써 실현되는 특정 면역 방어 인자입니다. 감작 된 T 림프구에 의한 IFN-γ 합성의 유도는 마이코 박테리아의 항원과의 상호 작용을 일으킨다.

투베르쿨린 PPD로 사용되는 항원. 유전 공학에 의해 얻어진 특정 항원은 특정 항원에 ESAT-6 및 CFP-10 (여과 배양 10 kDa의 단백질) (초 항원의 분자량을 갖는 6 kDa의 분비). 유전 공학 또는 재조합 항원은 BCG 백신 및 기타 마이코 박테리아의 세포에는 존재하지 않습니다. 투베르쿨린 사용시 IFN-γ 유도 검사 결과는 투베르쿨린 피부 검사 결과와 비슷합니다 (직접 상관 관계). 유 전적으로 조작 된 항원을 사용하면 시험 결과가 더 구체적이 고 이전의 BCG 예방 접종에 의존하지 않습니다. 결핵 감염과 접촉하지 않은 예방 접종을받은 사람을 검사 할 때 검사의 특이도는 99 %입니다. 결핵 환자 중 검사의 민감도는 81에서 89 %까지 다양합니다.

테스트 및 진단 도구는 IFN-γ의 농도를이어서 함께 결핵균 관내 항원으로 또는 IFN-γ를 합성 T 림프구의 수를 카운트함으로써 혈액으로부터 분리 된 세포 또는 전체 혈액 단핵 세포의 단기 배양에 기초하여 개발되었다. 시험관에서 합성 된 인터페론의 농도는 IFN-γ에 결합하는 단일 클론 항체를 사용하는 ELISA에 의해 결정된다. 그런 다음 표준 IFN-γ를 보정하여 농도를 시험관 또는 시험판의 웰에서 결정합니다.

Elispot 검사를 시행 할 때, IFN-γ를 합성하는 T- limocytes의 수. IFN-γ에 대한 항체로 코팅 된 플레이트의 표면에서 계수된다.

의약품 및 미국 제품에 대한 기관의 승인을 유도을 통해 IFN-γ 체외에 개발자 Diagnosticum는 테스트가 활성 결핵 잠복 결핵 감염을 구별하는 것은 불가능이라고 주장한다. 따라서 감염 수준이 높은 지역에서는 검사가 직접 진단되지 않습니다. 그러나 우리나라에서는 어린이의 결핵 감염을 예방 접종 후 알레르기와 구별하고 치료 과정에서 특이적인 면역 수준을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

현재, 시험관 내에서 특정 결핵 항원에 의한 IFN-γ 합성 유도를 결정하기위한 국내 시험 시스템이 연구되고있다.

결핵, 면역 교정의 면역 상태 및 과정

사람의 결핵 치료 과정에서 항원 혈증 및 면역 체계의 상태가 변화합니다.

삼출액과 조직의 변화에 관한 자료는 대부분 모순적이다. 좋은 이유와 함께 주목할 수있는 유일한 것은 결절 육아종에서 원칙적으로 상당수의 활성화 된 T 림프구가 검출된다는 것입니다.

인간의 결핵 치료에서 면역 학적 기작의 역할을 이해하는 데 필요한 두 가지 조항을 더 갖고있는 것이 합리적이다.

• 에이즈 환자는 다제 내성이 특히 높습니다.
• 여러 약물 내성이있는 경우 (그리고 HIV 감염이없는 경우) 면역 장애 (특히 T 세포 링크)가 특히 중요합니다.

결핵의 면역 널리 다양한 방법을 적용 할 때 : 이는 주로 T 세포 면역 작용에 주로 약물 및 단핵 식세포의 시스템 (흉선 호르몬, 이소 포론, likopid, polioksidony 외.). (감쇠 된) 마이코 박테리아와 그 구성 요소들도 포함됩니다.

결핵에 대한 분자 생물학적 진단

특정 분석 특정 유형 또는 병원체 균주에 특이적인 염기 서열을 갖는 DNA 세그먼트 - 감염성 질환의 진단 분자 생물학 방법의 경우 등, 주로 방법의 특정 유전 물질을 식별하기 위해 세균 및 바이러스 성 병원체의 게놈 물질의 조작에 기초 특정 의약 물질에 대한 병원체의 감수성을 결정하고 기능 분석을위한 유전자의 DNA 염기 서열 병원체의 특정 유전자의 활성. 분자 생물학적 기술은 1985 년 개봉 후 과학 연구 및 진단에 실용화 각종 세균 및 바이러스 감염을 모니터링 하였다 널리 캐리 Myullisom 중합 효소 연쇄 반응 (노벨상. 1989 수상).

중합 효소 연쇄 반응 법의 원리와 가능성

PCR은 시험 관내에서 수 시간 동안 수 시간 동안 뉴클레오티드 서열 (병원체의 DNA 단편)을 증폭 (증식)시킬 수있게한다. 단일 DNA 사슬의 존재 하에서의 반응은 분석의 극도로 높은 감도를 결정합니다.

DNA 사슬의 특정 영역의 뉴클레오티드 서열은 미생물의 유전 적 동일성을 결정하며, PCR의 높은 특이성을 설명합니다.

매우 느린 성장을 갖는 미생물의 결핵균 생물학적 특성에 의해 야기되는 특성의 검출을 조사하고이 기술의 가치 : 결핵균 DNA의 배가 시간 배양은 12-24 시간으로합니다.

PCR 방법의 원리는 수백만 배의 증폭으로 구성됩니다. 상이한 온도 체계를 통과하는 다음 3 가지 반응 단계의 순환 반복 동안 튜브 미세 체적 내의 특정 DNA 서열의 섹션을 곱하는 단계 :

• 1 단계 - 사슬의 발산으로 가열시 이중 가닥 DNA의 변성;
• II 단계 - DNA 단편의 증식을 위해 엄격하게 특이 적으로 사슬의 말단 부분을 갖는 프라이머 (프라이밍 올리고 뉴클레오타이드)의 상보 적 결합 (하이브리드 화);
• 단계 III - 열 안정성 DNA 중합 효소의 도움을 받아 DNA 단편 사슬을 완성합니다.

시험 관내에서 증폭을 위해서는 매트릭스 DNA 분자가 있어야합니다. 아데닌 (A), 티민 (T), 구아닌 (D), 시토신 (C)의 상응하는 질소 염기를 함유하는 4 종류의 데 옥시 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (뉴클레오타이드); 18-20 염기쌍으로 이루어진 인위적으로 합성 된 프라이밍 올리고 뉴클레오타이드 (프라이머); 68-72의 최적 온도를 갖는 열 안정성 DNA 중합 효소 ^상의 C, 마그네슘 이온.

PCR의 특이성은 DNA 단편의 선택에 달려있다. 이에 따라 플랭크 시드 올리고 뉴클레오티드가 합성된다. 하이브 리다이 제이션과 DNA 사슬의 완성의 특이성은 다음과 같은 쌍의 질소 염기의 상보성 원리에 기인합니다 : 아데닌 - 티민, 구아닌 - 시토신.

결핵균 게놈의 대부분의 균주에 특이성 분석의 높은 감도와 함께 제공 반복 상당한 수 (10-20)를 갖는다 IS6110의 DNA 단편을 선택 가장 테스트 시스템의 게놈 결핵성 항산 균 착체 가장 효율적인 표적 증폭을 결정한다. 동시에 적은 수의 반복을 갖는 Mycobacterium tuberculosis의 균주 또는 IS6110 단편의 부재가 설명됩니다.

생물학적 시료에서 DNA 분자 분리

PCR을 수행하기 위해, 병원체의 DNA 분자는 최소량의 비 생물학적 DNA와 효소 -DNA 중합 효소의 다양한 저해제로 최소한의 부피로 생물학적 물질로부터 분리되어야한다.

시료의 준비는 분리 된 DNA 분자에 의한 시료의 교차 오염을 방지하는 조건 하에서 수행되어야한다. 이를 위해 염소 함유 용액에는 자외선, 바닥 및 책상 및 가전 제품 작업 표면이있는 전처리가 필요합니다. 또한 깨끗한 장갑, 일회용 시험관 및 팁을 자동 피펫에 의무적으로 사용합니다.

3-4000에 시료를 원심 분리에 충분한 임상 검체에서 결핵균의 DNA (뇌척수액, 기관지 세척) 이들 세포, 세포 파편 또는 염을 다수 함유하지을 분리. RPM을 오니 20-30 UL 2 % 용액에 추가 트리톤 X-100 및 90 가온 ^{에 대해} 30 분 동안 C.

시료의 점도에 따라 - 객담 시료의 제조는 일반적으로 샘플 당 50 내지 80 mg의 양으로 수산화 나트륨 및 N- 아세틸 -L- 시스테인 (NALC)의 4 % 용액에 사용되는 효율적인 액화되어야하지만. NALC 용액은 반드시 준비되어야하며, NALC 파우더는 시료에 직접 첨가하여 건조시킬 수 있습니다. 액화 후, 시료는 나사 캡이 달린 50 ml 바이알, 즉 E.에 3.5-4,000 rpm (3000 g)으로 15 분간 원심 분리되어야한다. 가래의 사전 준비에 권장되는 조건과 동일한 조건에서.

펠릿에있어서의 DNA의 추출을위한 대부분 미다 입자 및 실리콘 산화물 ( "규조토") DNA 분자를 흡장 같은 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 용해 시약 5-6 몰 용액의 사용에 기초하여 사용된다. 그 DNA 분자가 물에서 탈착 한 후, 구 아니 디늄 이소 티오 시아 네이트와 에탄올 용액 2.5 몰 용액으로 세척하고 가능한 억제제, 이들 샘플을 포함한 비특이적 물질, PCR을 수행 하였다. DNA 추출 기술을 단순화하기 위해 "규조토"는 종종 실리콘 산화물로 코팅 된 자성 미립자로 대체됩니다. 이 경우 원심 분리 대신 미세 튜브 용 특수 자기 스탠드를 사용하여 입자를 침전시킵니다.

러시아에서는 mycobacteria의 면역 자기 적 분리를위한 독창적 인 방법이 개발되었고 그 다음에 병원균의 DNA가 추출되었다. 결핵균 면역 자기 분리, 실리카 코팅 3-5 미크론 ferroparticles 크기를 사용하는 화학적 결합 클론 (토끼) 결핵균에 대한 항체에 의해 결합되는. 알칼리 분해 후 가래의 샘플을 산성 트리스 -HCl 용액으로 중화시키고 면역 자기 흡수제로 배양한다. 그런 다음, 면역 핵 입자는 교체 가능한 팁이있는 자성 막대로 모아 마이크로 튜브로 옮겨 침전됩니다. 20-30 μl의 2 % Triton X-100 용액을 첨가하고 90 ^° 에서 30 분간 따뜻하게합니다 . 상등액을 PCR 분석을위한 DNA 주형으로 사용합니다.

어려운 문제는 생검 표본에서 mycobacterium tuberculosis DNA를 분리하는 것입니다. 효소 생체 검사의 경우, 효소 프로 테이나 제 K는 56 ^° C 의 온도에서 하룻밤 동안 200-500 mg / l의 최종 농도로 사용됩니다 . 또한, 공지 된 방법 중 하나가 사용된다. 생검의 PCR 분석에서 과도하게 비특이적 인 DNA는 반복적으로 DNA를 추출해야하는 반응을 억제합니다.

결과 감지 방법

반응 완료 후, 증폭 된 병원체의 DNA 단편을 다양한 방법으로 동정한다.

겔 전기 영동 방법은 잘 알려져있다. 생성 된 DNA 단편은 원하는 특정 DNA 단편을 함유하는 양성 대조군에 의해 또는 단편의 공지 된 크기 (뉴클레오타이드 쌍 수)에 따라 확인되며, 표준 분자 표지를 사용하여 결정한다.

특정 염료가 존재할 때 ethidium bromide가 이중 가닥 DNA에 포함됩니다. 합성 된 DNA 단편은 자외선의 작용 하에서 발광하는 밴드로서 검출된다.

전기 영동에 의해 시작부터 거리에 의해 결정되는 DNA 단편의 크기는 알려진 분자량 마커 또는 양성 대조군과 일치해야합니다.

예를 들어 효소 반응을 통해 검출 하였다 비오틴 표지 DNA 프로브, 스트렙 타비 딘 - 비오틴 알칼리 포스 파타 아제에 결합함으로써 - 올리고 그것에 상보와 PCR 제품 단쇄의 하이브리드 화에 기초한 PCR 결과를 결정하는 다른 방법.

이러한 유형의 검출에 기초하여, 효소 반응의 발현 후 샘플에서 광학 밀도를 판독 한 결과로서 PCR 결과의 검출이 자동적으로 수행되는 PCR 분석기가 생성되었다.

이 방법의 단점은 DNA 분자의 짧은 단편에 의한 병원 내 오염의 가능성이다. 분자가 새로운 샘플을 입력하면, PCR을위한 매트릭스가되고 잘못된 결과가 나타납니다.

이와 관련하여, 거짓 긍정 결과를 방지하기 위해, 구내 분리 및 격리에 대한 엄격한 규칙이 도입됩니다. 생물학적 시료에서 DNA를 추출합니다. 청정 구역에서 결과 (전기 영동) 검출을위한 전제. 이러한 전제는 오염 가능성이있는 구역입니다. 또 다른 고립 된 영역은 테스트 할 DNA 샘플을 PCR을위한 반응 혼합물과 함께 튜브에 도입하기위한 청정실이다. 마지막으로, 주 장치 인 DNA 증폭기는 별개의 가능한 사무 실에 설치되어야한다고 가정합니다.

선행 반응의 생성물의 오염을 방지하기 위해 - 일부 Likon A-PCR 시스템을 시험하는 대신 dezoksinukleozidtimidina를 포함하는 dezoksinukleoziduridin, 시험 관내 합성 회로는 적절한 위치에 대신 포함 할 때, 즉, 천연 DNA에 존재하는 티민의 질소 염기는 우라실로 대체됩니다. 분석중인 물질에 대한 반응 혼합물에 첨가 된 Uracil-DNA glycosylase는 deoxyuridine으로 오염 물질 조각만을 파괴하지만 분석 대상 DNA는 파괴하지 않습니다. 을 포함한다. 94 ^° C 에서 계속해서 가열 하면이 효소가 비활성화되고 PCR에서 증폭을 방해하지 않습니다.

RRNA의 등온 증폭을 기반으로하는 시험 시스템이 있는데,이를 위해 역전사와 DNA 분자 합성이 먼저 수행됩니다. 이는 다시 RNA 분자의 후속 합성을위한 매트릭스입니다. RNA 증폭 물은 반응 튜브 용액에서 하이브리드 화 될 때 아 크리 딘 염색 된 DNA 프로브를 사용하여 검출됩니다. 이 방법은 고감도 외에도 하나의 튜브에서 분석함으로써 오염을 방지 할 수 있다는 장점이 있습니다. 저자들에 따르면 호흡 샘플에서이 방법의 민감도는 99-100 %의 특이성으로 90 %에 이른다.

새로운 검출 방법은 실시간 PCR에서 구현됩니다. 이 방법들은 주로 PCR과 그 결과의 검출이 하나의 밀폐 된 튜브에서 동시에 수행된다는 점에서 다릅니다. 이는 분석 기술을 기술적으로 단순화 할뿐만 아니라 이전 PCR 제품을 사용하여 실험실 및 테스트 샘플의 오염을 방지합니다.

실시간 PCR 검출 결과의 특정 DNA 단편 중 amplifitsi 루이-PCR와 형광 하이브리드 화 프로브 DNA 중에 발생하는 형광에 기인한다. 형광 표지는 PCR 동안 증폭 될 목적 DNA 분자로 특정 하에서 혼성화 소광 형광 분자로부터 효소 반응의 결과로 방출하거나 이격되도록 구조 형광 DNA 프로브를 구축 하였다. 프로브와 하이브리드 화 된 분자의 수가 증가함에 따라, 검출 가능한 수준으로의 형광 증가는 증폭 된 생성물의 분자 수에 비례한다. PCR 단편의 DNA 분자 각각의 싸이클 횟수에 있기 때문에, 절반으로 형광이 측정 초기 샘플 DNA 분자의 수에 반비례하여 증가되는 사이클의 수를 곱한다. 반응을 산출 할 수있는 컴퓨터 프로그램 및 시험 재료의 게놈 DNA의 양을 사용하여, 교정기로 결핵균의 DNA 단편을 상응하는 분자의 여러 가지 공지 된 농도를 도입하는 경우.

각 표준 시료가 복제됩니다. 정량적 인 기준은 결정된 형광의 개시 및 성장에 필요한 최소 PCR 사이클 수이다. 횡좌표에서 -주기의 수; 세로 좌표는 형광 값입니다. DNA 농도는 형광의 출현에 필요한 사이클 수에 반비례합니다. 오른쪽 열 (21-32)에는 해당 농도의 사이클 번호가 표시되어 있습니다. DNA 조각의 10 배 농도 사이의 차이 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 cycles. 2 명의 환자의 경우, IS6110 단편의 농도는 약 10 ³ / ml 및 10 ⁴ / ml이었다. Mycobacterium tuberculosis의 게놈에서 분석 된 단편의 반복 횟수 (6 ~ 20)를 고려하면 임상 샘플에서 myco-bacteria의 수는 각각 약 100 및 1000 세포입니다.

결핵 진단에있어서의 PCR의 사용

PCR 법은 결핵의 진단을 가속화하는데 가장 많이 사용됩니다 - 임상 검체에서 결핵균 검출 : 객담. 기관지 세척, 흉막 삼출액, 소변, 뇌척수액, 골 용해 점, 여성 생식기 흡인 및 다양한 생검 표본이 포함됩니다. 네덜란드의 연구에서 폐 결핵의 확진 340 명에서 약 500 객담 및 기관지 세척 샘플은 PCR 방법, 현미경 및 문화 연구 얼룩의 감도를 비교 연구 하였다. 분석의 민감도는 각각 92.6.88.9와 52.4 %였다. 모든 방법의 특이도는 약 99 %였다.

스 프리어 현미경 검사, Levenstein-Jensen 배지에서의 접종, VASTES 검사 시스템 및 PCR 분석에 의한 결핵균 검출의 효율성을 비교 하였다. PCR은 74.4 %의 민감도, 현미경 검사 - 33.8 %, 고밀도 배지에 48.9 %의 밀도 및 VASTES - 55.8 %의 민감도를 보였다. Levenstein-Jensen 배지에서 시딩하는 평균 감지 시간은 24 일입니다. 유모 - 13 일, PCR - 1 일.

결핵 치료의 효과를 모니터링하기위한 민감하고 신속한 방법으로 PCR을 사용할 수있는 가능성에 대해서도 논의한다.

더 긴 시간이 지남에 따라 결정 효과적인 화학 요법과 PCR에 의한 결핵균의 DNA의 검출은 - 1.7 형광 현미경에 정의 스미어와 비교 개월, 2.5 개월로 평균에 세균 검사와 비교.

폐결핵의 진단

그것은 비효율적 진단 재료 결핵균 결정하기위한 이러한 방법 추시 세균 종래 방법에 따라 형성 같은 민감한 PCR 방법으로 값이 폐외 형태에 특히 크다.

소변 샘플의 조사 PCR 결과 및 음극 활성 TB 환자 뇨 4 비활성 신장 결핵 및 비뇨기 계통 질환 nontubercular 39 명 16 17 명에서 양성이었다.

결핵의 의심이있는 경우 기원이 알려지지 않은 환자의 골수 흡인에 대한 PCR 분석의 효과가 입증되었습니다. 결핵성 림프절 염을 진단하기 위해 결핵성 림프절 염의 의심이있는 67 명의 어린이를 대상으로 102 개의 천자 흡인과 생검을 시행 하였다. 양성 결과가 얻어졌다 : 71.6 % 실시간 PCR. 형광 현미경 검사 - 46.3 %. 문화 연구 - 41,8 %. "cat scratch"질환이있는 환자에서 50 개의 림프절 생검을 실시한 결과, 모든 결과는 부정적이었다. 따라서, PCR 분석의 100 % 특이성이 입증되었다. 림프절의 천공 생검과 같은 연구에서, M. Avium의 검출 가능성이 증명되었다.

알려진 바와 같이, 여성 생식기 영역 불임의 결핵 진단은 진단의 가장 어려운 문제 중 하나입니다. 자궁 내막 생검 PCR에 의해 검사 할 때, 25 명 더글라스 공간 (14) (56 %)의 액체를 흡인 내막 샘플 복강경 검사 결핵 의심, 긍정적 인 결과가 얻어졌다. Smear microscopy와 배양을 이용하여 각각 1과 2의 결과를 얻었다. 이 경우도 PCR 양성이었다. 대부분의 PCR 양성 결과는 조직 학적 연구에 의하면 결핵의 특징적인 징후가있는 경우와 관련이 있었다. 더 작은 숫자 - 복강경 데이터에 따른 결핵 의심. 결핵에 대한 복강경 데이터가없는 경우 PCR 분석 결과는 단 한 가지 긍정적 결과 만 나타났습니다.

폐결핵을 진단 할 때 임상의는 종종 PCR 방법으로 혈액 샘플을 검사 할 때 병원균을 검출 할 가능성에 대한 질문을 받는다. 문학 데이터에 따르면 혈액에서 채취 한 결핵균의 DNA 검출은 광범위한 형태의 HIV 감염으로 가능합니다. 결핵균 DNA는 신장 이식 및 면역 억제 환자에서 다양한 장기의 일반화 된 결핵으로 만 검출되었습니다.

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마이코 박테리아의 종별 식별

PCR 법은 초기 성장을받은 후 결핵 단지의 마이코 박테리아 및 마이코 박테리아 nontubercular의 어떤 종의 신속한 식별을위한 매우 효과적 일 수있다. 이 경우, PCR의 사용은 7-10 일을 절약 할 수 있으며, 결과적으로 긍정적 인 결과의 문화적 식별에 필요합니다. PCR 검사는 고감도를 얻기 위해 임상 시료의 복잡한 시료 준비가 필요 없기 때문에 기술적으로 매우 간단합니다. 이 테스트 시스템에서 긍정적 인 연구 80 (MB Vasto의. 오가논 회사)에서 PCR의 모든 긍정적 인 문화는 엄격하게 특정 및 일일 개최했다. 아 크리 딘과 혼성화 후 시각적 평가에 chemiluminometer 또는 니트로 스트립을 통해 발광의 모양에 의해 검출 된 특정 균주 표지 DNA 프로브와 하이브리드 병원균 배양 DNA의 제조에 결핵균의 다른 종의 동정을 행 하였다. 그러한 세트의 도움으로 한정된 수의 종 (Mycobacterium tuberculosis complex)이 확인됩니다. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii 및 M. Gordonae.

A.Telenti et al. 또한 두 가지 제한 효소 (효소 특성이 특정 지점에서 DNA 분자를 절단 갖는)와 종 PCR에 의해 결핵균의 임상 적으로 중요한 종의 식별 및 후속 처리를 비교적 간단하고 저렴한 방법을 개발 하였다. DNA 단편이 증폭됩니다. 열충격 단백질 (65 kDa)을 암호화하고, PCR에 의해 생성 된 439 개의 뉴클레오타이드 쌍의 PCR 단편을 두 개의 효소 인 Bste II와 Nae III로 따로 따로 처리한다. 이어서 아가 로스 겔 전기 영동은 100 내지 1000 염기쌍으로부터 길이 DNA 단편의 표준 세트 (DNA 분자량 마커 -)를 사용하여 크기 (염기쌍의 수)를 결정하고, 두 제품을 수득하여 분석 하였다. 특정 유형 (결핵균, M. 테륨 아 비움, M. Intracellulare에, M. Kansasii, M.fortuitum)의 각각에서 각 제한 효소에 대해 서로 다른 크기의 두 개 또는 세 개의 DNA 단편을 검출한다. 얻어진 상이한 DNA 크기의 조합은 이들 종을 그들 사이에서 구별 할 수있게한다.

생물학적 DNA 마이크로 어레이의 기술이 개발되고 있습니다. 한 연구에서 100 종 이상의 미코 박테리아를 확인하는데 도움이 될 것입니다.

마이코 박테리아의 40 종의 식별을 허용하는 대응하는 기본 구성과 비교하면 종 식별은 증폭 시퀀싱 하였다 16S rRNA의 가변 영역의 PCR 증폭에 의해 수행 될 수있다.

PCR의 도움으로 M. Bovis 및 M. Bovis BCG의 분화를 포함하여 결핵균 복합체 내 종의 동정을 수행 할 수 있습니다. 이를 위해, RD1의 게놈 영역에서 일부 유전자의 유무가 분석됩니다. RD9 및 RD10. RD1은 M. Bovis BCG에는 없지만 M. Bovis를 포함하여 독성이있는 종에 존재한다.

PCR에 의한 Mycobacterium tuberculosis의 약물 감수성 측정

Mycobacterium tuberculosis의 약제 감수성 또는 저항성을 결정하기위한 분자 유전학 방법의 작업은 알려진 유전자의 특정 염기 서열에서 돌연변이의 검출으로 축소됩니다. 주요 방법은 증폭 후 이들 서열의 직접 판독 (서열화) 또는 DNA 프로브와 함께 PCR 동안 증폭 된 비오틴 - 표지 DNA 단편의 하이브리드 화에 기초한다. 방법 LIPA-하기 Rif-TB - 두 대안 이용한 DNA 프로브는 효소 접합체 (스트렙 타비 딘 - 알칼리성 포스파타제)을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 없거나 불완전한 혼성화 이어질 서열에 염기 치환을 식별하는 것을 포함한다.

로컬 DNA 메소드 호출 mikrobiochipov 내성 또는 약물 감수성에 대한 책임이있는 PCR 증폭 유전자 영역에 공지 된 돌연변이에 상보적인 프로브에 고정 microsections의 형광 측정 방법. 이 연구를 수행하기위한 주요 알고리즘은 다음과 같습니다. 마이코 박테리아의 임상 샘플 또는 배양 물로부터 DNA를 분리 한 후 리팜피신 또는 결핵균의 단백질 이소니아지드 감도에 대한 책임 부호화 katG 및 인하 유전자 약물 감수성에 대한 책임 rpoB 유전자 관련 단편의 PCR 증폭을 수행 할 필요가있다. PCR 결과가되는 소정 길이의 적절한 DNA 단편의 수신을 확인한 아가 로스 겔 전기 영동으로 평가 하였다. 그런 다음 두 번째 PCR을 수행하여 형광 라벨을 DNA에 삽입합니다. PCR의 결과는 겔 전기 영동에 의해 다시 확인된다. 그 후, 혼성화가 작은 유리판 짧은 DNA 가닥 가능한 변이 점에서 약물에 민감한 형 결핵균의 서열을 뉴클레오티드 상보 (프로브)에 고정 된 다수의 인 바이오칩에 생성 된 물질을 세척 한 후, (밤새 배양)을 행했다. 또한 약물 내성을 담당하는 돌연변이 서열에도 적용될 수있다. 접시에 DNA 프로브의 위치 - 엄격히 정의되고, 혼성화시에 관찰 된 형광의 레벨이 설치된 전용 판독 장치를 사용하여 결과를 판정한다. 이와 관련하여 분석 결과는 특수 컴퓨터 프로그램을 통해 결정됩니다.

최근에는 실시간 PCR 기술을 바탕으로 결핵균의 약물 감수성을 측정 할 수있는 대체 방법이 개발되어 폐쇄 형 튜브 검사에서 이러한 연구를 수행 할 수있게되었습니다.

Fig. 13-13 실시간 PCR에 의해 리팜피신에 대한 내성을 결정 결핵균 임상 분리의 분석 결과 나타낸다 : 218 - 대조군 샘플 (리팜피신에 민감한); 93 - Ser-Trp TCG-TGG의 돌연변이에 대한 양성 대조군; 4482 - Ser-Leu TCG-TTG의 돌연변이에 대한 양성 대조군; 162-322 - 실험 샘플. 4 채널에서의 증폭 동역학 곡선 계산 결과 : 채널 1 : Ser-Trp TCG-TGG의 돌연변이에 대한 393 양성 대조; 채널 2 : 4482 - Ser-Leu TCG-TTG의 돌연변이에 대한 양성 대조군; 162, 163, 172, 295 - 실험 샘플; 채널 4 : 실험에 참여하는 모든 샘플의 증폭의 운동 곡선. 증폭 반응의 양성 조절. 결론 : 분석 결과를 바탕으로 리팜피신에 대한 내성을 결정하는 다음과 같은 돌연변이가 확인되었다 : 샘플 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. 동일한 원리가 가장 빈번한 돌연변이를 결정하는 유전자 katG와 inhA에 대한 isoniazid에 대한 약물 내성을 결정하는 데 사용되었습니다.

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Mycobacterium 결핵의 균주 확인

결핵균 균주의 식별을 가장 잘 연구 방법은 결핵균의 DNA 효소 PVU II의 fragmentirovanin (제한)에 기초하여 단편 DNA에 어떤 특정한 순서로 후속 혼성화를 수득하는 기술이라는 제한 효소 절편 길이 다형성 (RFLP의 RFLP. 또는 영어 버전)이며 반복되는 요소 IS6110. 종내 변화는 반복의 IS6110과 DNA에 자신의 위치의 다양한 숫자를 통해 깨달았다. 특정 효소 제한 효소 공격 지점 (제한 효소)과 IS6110 요소 사이의 거리의 다양성이 포함됩니다. 이 기술은 매우 복잡하고 시간이 오래 걸립니다. 결핵균의 배양 물로부터 추출 된 DNA와 함께 처리 한 후, 겔 전기 영동은 제한 효소로 수행되고, 그 후 니트로 셀룰로오스 막에 다른 길이의 DNA 단편을 전달 혼성화는 IS6110 요소의 파편으로 수행하고 효소 반응에 의해 검출되었다. 얻어진 패턴 특정 DNA 밴드는 결핵균의 특정 균주의 특징. 컴퓨터 분석의 도움으로 변종의 동일성 또는 관련성이 드러납니다. RFLP 방법이 가장 차별적이라는 사실에도 불구하고, 분석 균주의 차이의 최대 개수를 식별하며, 이는 소수의 몇몇 균주에서 관찰 (5 미만) IS6110-반복에 대한 효과가있다. Fig. 도 13-14는 균주의 RFLP 형질 결과를 나타낸다.

대안으로 spoligotyping의 방법 - spacer DNA sequence의 polymorphism 분석 - DR region의 직접 반복 사이의 중간 단계가 될 수있다. 균주의 사형체 형성을 수행 할 때, DR 영역을 경계하는 프라이머로 PCR을 수행 한 후, DNA의 가변 중간 영역과 하이브리드하는 상이한 길이의 단편이 형성된다. DR 영역의 스페이서 서열의 분석이 제시된다. 연구원에 따르면, 더 단순하고 생산적이며 변종 및 예비 역학 분석의 1 차 스크리닝 및 임상 재료 직접 연구에 적합합니다.

분명히, 더 효과적이고 기술적으로 가능한 방법은 VNTR (영어 단어의 약어) 또는 결핵균의 정확한 DNA의 탠덤 반복의 가변 수를 결정하는 방법이다. 이 방법은 PCR의 사용에만 근거하며 추가적인 조작이 필요하지 않습니다. 상이한 균주 및 상이한 좌위에서의 직렬 결합의 수가 상이하기 때문에, 상이한 크기의 단편이 PCR 산물의 결과 전기 영동상에서 결정되고 분석된다. 연구자들에 따르면, VNTR을 사용하면 RFLP 방법보다 변형률의 차별성이 더 높아진다.

근래에는 약물 저항성이 큰 W-Beijing 계통 (때때로 북경주라고도 함)의 Mycobacterium tuberculosis 계통의 분포에 많은주의를 기울였습니다.

분자 생물학 연구의 질에 대한 기본 요구 사항

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PCR에 대한 기본 규정 문서

주문 보건 러시아 행정부 : 2000년 2월 7일의 g에서 №45 ... 2003년 3월 21일의 g에서 번호 109 .. 2000년 2월 21일, 가이드 라인에서 숫자 64 : 1.3.1888-04는 "PCR 재료를 사용하여 연구 작업 조직 병원성 생물에 감염 병원성 III-IV 군의 제제 "; 1.3.1794-03 "I-II 병원성 그룹의 미생물에 감염된 PCR 물질 연구에 관한 연구 조직". 2003; 3.5.5.1034-01 "물질의 오염 제거, 박테리아 감염 I-IV의 병원성 그룹 PCR 사용"2,001 식별, 진단, 결핵의 치료에 미생물 검사 방법에 대한 통일 된 지침 부록 11.

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직원

분자 생물학적 연구의 실행이 차 의학 교육과 임상 실험 실용 진단, 의사, bacteriologists이, 바이러스 학자, 의사, 생물 학자, 임상 진단 실험실뿐만 아니라, 전문가의 의사를 보유 할 수있다, 규정 된 방식으로 전문화 및 고급 교육을 통과시켰다.

실험실 구내 배치

다음 실험실이 필요합니다.

• 시료 취급 구역은 절차 지침 13.1888-04에 따라 III-IV 병원성 그룹의 전염성 병원체와 작업하기에 적합한 실험실입니다.
• 반응 혼합물 준비 구역 PCR - 내부 실험실 오염으로부터 보호 해주는 실험 실 - "깨끗한"구역.
• • 전기 영동 또는 하이브리드 화를 사용하여 PCR 산물을 분석 할 경우. 승산 DNA 단편이 증폭 튜브로부터 추출 된 실험 방 각각 PCR 실험실에 대한 요구 사항에 따르면, 환경 (1.3.1794-03 지침 안내 1.3.1888-04)를 얻을 수 있어야 완전히 이전 단락에서 설명한 구내와 격리되어 있습니다. 시료 처리 및 인력, 설비, 임의의 재료 및 개체의 "클린"영역에 대한 전기뿐만 아니라, 환기 시스템을 통한 공기의 이동 또는 어음의 결과를 영역으로 이동 영역에서 제외한다. PCR 산물의 형광 검출에는이 구역이 필요하지 않습니다.
• 문서화 및 결과 처리를위한 공간에는 컴퓨터와 필요한 사무 장비가 설치되어 있습니다. 이 방에는 튜브를 열지 않고 PCR 제품을 검출 할 수있는 장비가있을 수 있습니다. - 실시간 PCR을위한 형광 PCR 검출기 및 열 순환 장치.

객담의 일차 치료를위한 위생 및 역학 요구 사항은 결핵균에 대한 표준 미생물 요구 사항과 유사합니다.

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PCR 진단용 실험 장비 완성

실험실에는 다음 방을위한 장비가 포함되어 있습니다.

• 샘플 준비를위한 공간은 다음과 같은 장비를 포함합니다 : II 등급의 보호 층 "SP-1.2": "Eppendorf"유형의 시험관 용 히터 커버가있는 고체 상태 자동 온도 조절 장치; 13,000 rpm으로 미세 원심 분리기; 원심 분리기 (Vortex); -20 온도 범위 냉장고 ^에 C (10) ^{에 대한} C; 다양한 볼륨의 "Rroline"시리즈 피펫; OM-1 트랩 플라스크가있는 펌프; 피펫을위한 삼각대; 삼각대 워크 스테이션 200x0.5 ml; 삼각대 워크 스테이션 50x1.5 ml; 시험관을 보관하기위한 받침대 80x1.5 ml;
• 반응 혼합물 준비실 : 보호 챔버 PCR-box ( "Laminar-C. 110 cm); 원심 분리기 - 와동; Proline 시리즈의 다양한 볼륨 피펫; 피펫을위한 삼각대; 삼각대 워크 스테이션 200x0.2 ml; 시험관을 보관하기위한 받침대 80x1.5 ml; -20 온도 범위 냉장고 ^에 C에 + 10 ^의 C;
• 전기 영동을위한 방 : 수평 전기 영동을위한 사진기; 전원 공급 장치; 트랜스 루미 네이트;
• 컴퓨터와 소프트웨어로 DNA 증폭 또는 핵산 분석기 (실시간 PCR); 모든 여분의 방에 배치 할 수 있습니다. 실시간 PCR 기술이 사용되는 경우. 전기 영동을위한 공간이 필요하지 않습니다.

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외부 품질 관리

객관적으로 신뢰할만한 결과를 얻으려면 실험실 연구실의 품질에 대한 외부 평가 시스템에 참여해야합니다.

품질 관리 시스템의 참가자는 다음을받습니다. 대장균 E. 코코넛 10에서 결핵균 (avirulent 균주)와 튜브 (3)가 포함되어있는 두개의 동결 건조 균체 현탁액의 튜브 (12), ² / mL로; 10 ⁴ / ml 의 농도로 유사한 균주의 세포를 갖는 3 개의 앰풀 ; 비 결핵균 인 마이 코박 테 리움 M. Avium-intracellulare와 M. Kansasii를 2 ⁵ 앰블 / ml 농도로 함유하고있다 .

외부 품질 평가를위한 분산 테스트는이 분야에서 광범위한 경험을 가진 두 개의 독립적 인 실험실에서 사전 테스트를 거쳤습니다.

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