결핵의 실험실 진단

결핵은 현대의 상황과 과학적 업적을 통해 진단이 쉬운 질병입니다. 결핵의 실험실 진단은 다른 진단 방법들 중에서도 X선 검사법에 이어 두 번째로 중요한 위치를 차지합니다.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

임상 혈액 검사

결핵 환자의 경우, 일반 혈액 검사의 변화는 병인학적 특징이 아닙니다. 제한적이고 저활동성 결핵에서는 정상 수의 적혈구 저색소증이 특징적입니다. 광범위 건락성 림프절염, 특정 장 손상, 대량 폐출혈 또는 수술 후 출혈을 동반한 대량 침윤성 폐렴이나 건락성 폐렴에서는 적혈구 감소증과 소구증, 과소색소증, 다색소증이 관찰됩니다. 대적혈구증, 특히 변적혈구증은 훨씬 드물게 나타나며, 대개 중증 빈혈과 함께 나타납니다. 결핵의 보상기 망상적혈구 수는 0.1~0.6%, 준보상기 망상적혈구증은 0.6~1.0%, 비대상기 망상적혈구증은 1%로 특징적입니다.

일부 결핵 사례에서는 중등도의 백혈구 증가증(최대 15,000개의 백혈구)이 관찰될 수 있으며, 드물게는 백혈구 감소증이 나타날 수 있는데, 이는 제한적이고 가벼운 형태의 결핵 환자의 경우 2-7%에서 발생하고 파괴적이고 진행성 폐결핵 환자의 경우 12.5%에서 발생합니다.

백혈구 수식의 변화는 대부분 발생합니다. 상대적 호중구증가와 절대적 호중구증가가 모두 관찰되며, 백혈구 수식의 좌측 전골수구 쪽으로의 중등도 이동이 관찰됩니다. 단순 결핵에서는 골수구가 매우 드물게 관찰됩니다. 결핵 환자의 혈액도에서 병리학적 세분성을 보이는 호중구 수의 증가는 항상 결핵 진행 기간을 나타냅니다. 중증 결핵 환자의 경우 거의 모든 호중구가 병리학적 세분성을 보입니다. 결핵 발병이 진정되면 핵 이동은 비교적 빠르게 정상으로 돌아갑니다. 호중구의 병리학적 세분성은 일반적으로 혈액도의 다른 변화보다 오래 지속됩니다.

말초혈액 내 호산구 함량 또한 질환의 진행 단계와 유기체의 알레르기 상태에 따라 변동합니다. 질병이 심각하고 장기적으로 발병하면 호산구 수가 감소하여 무호산구증가증으로 나타나고, 반대로 침윤물과 흉막 삼출액의 재흡수 및 초기 원발성 결핵에서는 호산구 수가 증가합니다.

대부분의 원발성 결핵은 림프구 감소증을 동반하며, 특정 변화로 인한 흉터가 생긴 후에도 수년 동안 관찰되는 경우도 있습니다. 급성기의 이차성 결핵은 진행 정도에 따라 정상 림프구 수 또는 림프구 감소증을 동반할 수 있습니다.

결핵 진행 과정을 평가하는 검사 중 적혈구 침강 속도(ESR) 측정은 특별한 역할을 하는데, 이는 결핵 진행 과정을 평가하고 활성형을 식별하는 데 중요합니다. ESR의 증가는 병리학적 과정(감염성 및 염증성, 화농성, 패혈성, 혈모세포증, 림프육아종증 등)의 존재를 나타내며 그 중증도를 나타내는 지표가 되지만, 정상 ESR 수치가 항상 병리학적 증상이 없음을 나타내는 것은 아닙니다. 적혈구 침강 속도는 혈액 내 글로불린, 피브리노겐, 콜레스테롤 함량 증가 및 혈액 점도 감소에 의해 촉진됩니다. 적혈구 침강 속도 감소는 혈액 농축, 알부민 및 담즙산 함량 증가를 동반하는 질환의 특징입니다.

결핵 환자의 혈액도는 치료 기간 동안 변화합니다. 치료가 성공적일수록 혈액학적 변화는 더 빨리 사라집니다. 동시에 다양한 항균제가 조혈에 미치는 영향을 고려해야 합니다. 이러한 항균제는 종종 호산구증가증을 유발하며, 경우에 따라 백혈구증가증, 그리고 더 흔하게는 무과립구증 및 림프구-망상 반응까지 유발하는 백혈구감소증을 유발합니다. 체계적인 혈액학적 모니터링과 수집된 데이터의 정확한 분석은 환자의 임상 상태, 치료 과정의 역학, 그리고 치료 효과를 평가하는 데 필수적입니다.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

임상 소변 분석

요로결핵의 경우 소변 검사가 주요 검사실 진단 방법입니다. 백혈구뇨, 적혈구뇨, 단백뇨, 저등뇨, 결핵성 항산균뇨, 비특이적 세균뇨를 관찰할 수 있습니다.

백혈구뇨증은 특정 항암화학요법 전 요로결핵의 가장 흔한 증상이며, 요관 내강이 완전히 막히는 등 예외적인 경우에만 나타납니다. 네치포렌코 검사(소변 1ml 내 백혈구 수 측정)는 신결핵에서 백혈구뇨증의 정도를 더욱 객관적으로 평가하고, 경우에 따라 정상적인 일반 소변 검사로 백혈구뇨증을 진단하는 데 도움이 됩니다. 그러나 급성 및 만성 신우신염, 방광염, 요도염, 신장 결석 및 요관에서도 백혈구뇨증이 발생할 수 있다는 점을 고려해야 합니다.

적혈구뇨증은 백혈구뇨증과 마찬가지로 비뇨생식기 결핵의 가장 흔한 검사실 징후 중 하나로 간주됩니다. 혈뇨의 빈도는 결핵의 유병률에 따라 달라지며, 신장에서 파괴적인 결핵 과정이 진행됨에 따라 증가합니다. 백혈구뇨증이 없는 적혈구뇨증은 신결핵 초기 단계에서 더 흔하게 나타납니다. 백혈구뇨증보다 혈뇨가 더 많이 나타나는 것은 신결핵을 비특이적 신우신염과 감별할 때 신결핵을 뒷받침하는 중요한 근거가 됩니다.

[ 10 ], [ 11 ], [ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

생화학적 혈액 검사

결핵에서 일부 생화학적 지표의 변화는 주로 진행 단계, 합병증 및 다양한 동반 질환에 따라 달라집니다. 폐 및 기타 장기의 비활동성 결핵 환자의 경우, 혈청의 총 단백질 및 단백질 분획은 변하지 않으며, 정상 함량을 결정합니다.

질병의 급성 형태와 만성 결핵의 악화 및 진행에서 알부민 글로불린 계수는 감소합니다.

결핵 및 그 합병증에서 간의 기능적 상태와 기질적 손상을 평가하는 데 있어 매우 중요한 것은 혈청 내 직접 및 총 빌리루빈, 아스파르트산 아미노전이효소(AST), 알라닌 아미노전이효소(ALT) 측정입니다. 결핵 환자, 특히 중증 결핵 환자의 치료에서 아미노전이효소 수치의 동적 측정은 결핵 환자의 생화학적 검사의 필수 요소이며 매달 시행됩니다.

신장 기능 평가에는 혈청 크레아티닌 측정과 Cockcroft-Gault 공식을 이용한 사구체 여과율 계산이 포함됩니다. Reberg 검정을 이용한 사구체 여과율 계산은 정확도가 떨어집니다.

결핵 환자에 대한 동적 생화학적 연구의 주요 목적은 치료 과정을 모니터링하고, 약물의 부작용을 시기적절하게 감지하며, 새롭게 나타나는 체내 항상성 장애를 적절히 교정하는 것입니다.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ]

폐외결핵에 대한 생화학적 연구 방법의 적용

가장 유익한 지표는 생물학적 유체의 결핵성 혈소판 함량으로 여겨지지만, 이를 측정하는 데는 기술적인 어려움(가스 크로마토그래피와 질량 분석법을 사용해야 함)이 따릅니다.

활막, 심낭, 복수 또는 뇌척수액에서 측정되는 효소인 아데노신 탈아미노효소의 활성을 측정하는 것은 유망합니다. 아데노신 탈아미노효소의 주요 생성원은 림프구와 단핵구입니다. 생체액에서 아데노신 탈아미노효소의 활성을 측정하면 결핵성 활막염, 림프절 결핵, 결핵성 수막염, 결핵성 장막염의 진단에 도움이 됩니다.

일부 생화학적 지표는 비특이성으로 인해 병변 근처의 체액에서만 측정됩니다. 지표 수치는 투베르쿨린을 피하 또는 피내 투여한 후(일반적으로 투여 전, 투여 후 48시간 및 72시간) 측정합니다. 이후, 지표 수치의 증가 정도(%)를 초기 수치 대비 계산합니다.

최적의 경우, 장기 특이 효소인 트랜스아미디나제의 활성은 소변에서 측정되며, 다양한 원인의 신장 손상에서 그 발현이 관찰됩니다. 트랜스아미디나제 연구는 국소 염증 과정을 악화시키기 위해 투베르쿨린을 피하 투여하는 경우에만 정당화됩니다. 트랜스아미디나제 활성은 투베르쿨린 50 TE 투여 초기 및 투여 후 24~72시간 후에 소변에서 측정됩니다. 발효뇨가 2배 이상 증가하면 82%의 경우 신장의 활동성 결핵과 만성 신우신염의 악화를 감별할 수 있습니다.

여성 생식기 결핵의 경우, 혈액 내 합토글로빈과 말론디알데히드의 농도는 유발 투베르쿨린 검사 조건 하에서 측정한다. 투베르쿨린은 50 TE 용량으로 피하 투여하고 72시간 후에 생화학적 검사를 반복한다. 결핵 병인의 경우, 합토글로빈 수치 증가 정도가 최소 28%이고, 말론디알데히드 수치가 39% 이상이다. 더글러스 파우치에서 채취한 복강액에서 아데노신 데아미나제 활성도 측정도 이용한다. 천자는 전복벽의 내부 생식기 돌출 부위에서 0.1 TE 및 0.01 TE 용량의 투베르쿨린을 피내 투여한 후 72시간 후에 다시 검사한다. 아데노신 탈아미노효소 활성이 초기 값에 비해 10% 이상 증가하면 결핵성 과정을 나타냅니다.

눈 손상의 경우, 항원 자극에 반응하여 눈에서 발생하는 국소 반응을 검사합니다. 이 경우, 시각 기능 저하를 동반한 급격한 반응 발현은 바람직하지 않습니다. 경미한 국소 반응의 평가는 종종 어렵기 때문에, 결론을 객관화하기 위해 혈청 내 합토글로빈 또는 아데노신 탈아미노효소의 증가 정도에 동시에 초점을 맞추는 것이 좋습니다.

모든 생화학적 연구는 다른 방법과 함께 수행되어야 합니다.

[ 20 ], [ 21 ], [ 22 ], [ 23 ]

혈액 응고 시스템에 대한 연구

결핵학에서 혈액 응고계 상태를 연구하는 것의 중요성은 많은 폐결핵 환자에서 객혈이나 폐출혈이 발생하고, 결핵 수술 치료 시 혈액응고 합병증이 발생하기 때문입니다. 또한, 자연적으로 발생하는 잠복성 혈관내 혈액응고는 질병의 경과와 항암화학요법의 효과에 영향을 미칩니다.

염증의 삼출성 요소가 우세한 폐결핵 환자에서는 혈액의 항응고 활성이 감소하는 것으로 관찰됩니다. 염증의 생산성 요소가 우세한 특정 폐 손상 유병률이 낮은 환자에서는 혈관 내 혈액응고가 유의미하게 나타나지 않습니다. 객혈과 폐출혈을 동반한 폐결핵 환자에서는 혈액 응고계 상태가 다릅니다. 객혈이 최고조에 달했을 때 또는 객혈이 멈춘 직후 경미한 출혈이 있는 환자에서는 "구조적" 응고능은 증가한 상태를 유지하면서 트롬빈 형성 과정이 현저하게 강화되어 혈액 응고 능력이 급격히 증가합니다. 대량 출혈이 있는 환자에서는 피브리노겐 농도, 제13인자 활성, 혈소판 수의 감소로 인해 응고 잠재력이 감소하는 것으로 관찰됩니다. 제한형 폐결핵 환자의 수술적 치료 단계에서는 항상성 체계에 심각한 장애가 발생하지 않습니다. 하지만 광범위한 병변을 가진 환자의 경우, 전폐절제술이나 흉막폐폐절제술을 시행할 때 종종 DIC 증후군이 발생하며, 이는 "이차 질환"의 형태로 나타날 수 있습니다.

폐결핵 환자의 혈액응고계 상태를 모니터링하기 위해서는 활성화부분트롬보플라스틴시간(APTT), 피브리노겐, 트롬빈시간, 프로트롬빈지수는 물론 출혈시간, 혈액응고시간을 측정하는 것이 필요하다.

[ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ], [ 28 ]

호르몬 연구

최근의 실험 및 임상 관찰 결과, 특정 결핵성 폐 염증에서 호르몬 상태 변화가 관찰되었습니다. 항결핵 치료와 함께 뇌하수체-부신계, 뇌하수체-갑상선계, 그리고 췌장 기능 장애를 교정하면 특정 염증 부위의 섬유화 및 회복 과정이 활성화되는 것으로 입증되었습니다.

뇌하수체-갑상선계의 기능적 상태는 혈청 내 트리요오드티로닌(T3), 티록신(T4), 그리고 뇌하수체 갑상선 자극 호르몬(TSH)의 함량으로 판단합니다. _{폐결핵 환자의 38~45%에서 무증상 갑상선 기능 저하증이 발견되며}, 이는 파종성 및 섬유성 해면상 결핵에서 가장 흔하게 진단됩니다. 이러한 형태에서는 T3와 T4 수치가 가장 급격히 감소하며, _{이러한 호르몬의불균형 은 T4/} T3 _비율 의 증가로 나타납니다.

부신 피질의 기능은 혈청 코르티솔 수치로 평가하고, 췌장의 내분비 기능은 면역반응성 인슐린 농도로 평가합니다. 감염성 질환의 급성기에는 내인성 코르티솔과 인슐린의 필요성이 증가합니다. 고인슐린혈증은 또한 신체 조직의 인슐린 저항성을 나타내며, 이는 모든 활성 염증 과정, 특히 특정 염증 과정에서 전형적으로 나타납니다. 활동성 폐결핵에서 부신의 글루코코르티코이드 기능을 측정하면 대부분의 환자에서 과부하증의 존재를 감지할 수 있습니다. 급성기에 감염성 염증 환자의 정상 혈중 코르티솔 농도는 부신 피질의 글루코코르티코이드 기능의 상대적 부족으로 간주되어야 하며, 이는 적절한 용량의 글루코코르티코이드로 대체 요법을 시행하는 근거가 될 수 있습니다.

폐결핵 환자의 거의 3분의 1이 정상 하한선에 근접하는 낮은 인슐린혈증 수치를 보이며, 13~20%는 심각한 고인슐린증을 보입니다. 상대적 저인슐린혈증과 고인슐린혈증은 모두 다양한 중증도의 탄수화물 대사 장애 발생에 대한 고위험 인자입니다. 췌장 B세포의 기능적 활성도의 이러한 변화는 결핵 환자의 정기적인 혈당 모니터링과 당뇨병의 적기 예방을 요구합니다. 또한, 이는 결핵의 복합 치료에서 생리적 용량의 인슐린 사용이 적절하다는 추가적인 근거가 됩니다.

일반적으로 갑상선 호르몬 수치 감소, 불균형, 고코르티솔혈증, 고인슐린혈증은 결핵 과정이 심각하게 진행된 환자에게 가장 두드러지게 나타나며, 광범위한 폐 병변과 뚜렷한 결핵 중독 증상이 나타납니다.

결핵의 미생물학적 진단

미생물학적 연구는 결핵 환자를 식별하고, 진단을 확인하고, 항암 화학 요법을 모니터링하고 교정하고, 치료 결과를 평가하는 데 필요합니다. 다시 말해, 결핵 환자가 등록되는 순간부터 등록에서 삭제될 때까지의 모든 과정에 필요합니다.

모든 역학 프로그램과 프로젝트는 세균 배설자 수 평가를 기반으로 하는데, 이는 실험실적 방법을 이용한 결핵균 검출 없이는 불가능합니다. 소위 비조직화된 집단의 매력을 살펴보면, 세균 배설자 비율이 70% 이상에 달하는데, 이는 실험실적 방법이 이 집단에서 결핵 환자를 식별하는 데 상당히 효과적인 수단임을 보여줍니다.

결핵 진단을 위한 전통적인 미생물학적 방법은 세균학적 검사와 배양 검사입니다. 현대적 방법에는 자동화된 시스템에서 결핵균을 배양하는 방법과 PCR 검사가 있습니다. 그러나 이러한 모든 방법은 필연적으로 전통적인 세균학적 방법과 결합됩니다.

진단 자료 수집

실험실 검사의 효과는 진단 물질의 품질에 크게 좌우됩니다. 진단 물질의 수집, 보관 및 운반 규칙을 준수하고 환자 검사 알고리즘을 정확하게 구현하는 것은 검사 결과에 직접적인 영향을 미치며 생물학적 안전을 보장합니다.

결핵 검사에는 다양한 물질이 사용됩니다. 폐결핵은 결핵 감염의 가장 흔한 형태이므로, 주요 검사 물질은 객담 및 기타 기관지 분비물입니다. 에어로졸 흡입 후 얻은 상기도 분비물: 기관지 세척액; 기관지폐포 세척액; 기관지경 검사, 경기관 및 폐내 생검 중 얻은 물질: 기관지 흡인물, 후두 도말, 삼출물, 상처 도말 등

환자로부터 자료를 체계적으로 수집하면 연구의 효과가 높아집니다. 이를 위해 특별히 마련된 공간을 마련하거나 특별 부스를 구매합니다. 자료 수집은 위험한 과정이므로, 연구 자료는 감염 안전 수칙을 준수하여 수집해야 합니다.

결핵균 검사를 위한 물질은 환경의 오염을 방지하고 수집된 물질이 오염되지 않도록 단단히 닫힌 뚜껑이 있는 멸균 바이알에 수집됩니다.

진단 자료를 수집하는 바이알은 다음 요구 사항을 충족해야 합니다.

• 충격에 강한 재질로 만들어야 합니다.
• 고압멸균하면 쉽게 녹을 것입니다.
• 충분한 용량(40-50ml)을 갖추세요:
• 가래를 모으기 위한 넓은 개구부(직경 30mm 이상)를 가져야 함
• 수집된 샘플의 양과 질을 뚜껑을 열지 않고도 평가할 수 있도록, 다루기 쉽고 투명하거나 반투명해야 합니다.

최적의 연구 결과를 얻으려면 다음 조건을 충족해야 합니다.

• 물질 수집은 화학요법을 시작하기 전에 수행되어야 합니다.
• 연구에 필요한 자료는 아침에 식사 전이나 약을 복용하기 전에 수집해야 합니다.
• 연구를 위해 최소 3일 동안 아침 객담 검체를 채취하는 것이 좋습니다. 객담은 3일 연속으로 채취합니다.
• 수집된 자료는 가능한 한 빨리 실험실로 전달되어야 합니다.
• 재료를 즉시 실험실로 운반할 수 없는 경우, 기온이 4°C인 냉장고에 최대 48시간 동안 보관합니다.
• 재료를 운반할 때는 병의 무결성에 특별히 주의를 기울여야 합니다.

올바르게 채취된 객담은 점액성 또는 점액농양성을 보입니다. 검사할 객담의 적정량은 3~5ml입니다.

객담은 의료진의 감독 하에 채취됩니다. 객담 채취 담당자는 다음 규칙을 반드시 준수해야 합니다.

• 환자에게 검사 목적과 침이나 비인두 점액이 아닌 기도 깊은 곳의 내용물을 기침을 통해 뱉어내야 한다는 점을 설명해야 합니다. 이는 여러 번(2~3회) 심호흡 후 발생하는 가래 기침의 결과로 가능합니다. 또한 환자에게 구강 내 미생물총의 주요 부분과 가래 검사를 복잡하게 만드는 음식물 찌꺼기를 제거하기 위해 끓인 물로 먼저 입을 헹궈야 한다는 점을 알려야 합니다.
• 가래를 채취하는 의료종사자는 가운과 모자 외에도 마스크, 고무장갑, 고무 앞치마를 착용해야 합니다.
• 의사는 환자 뒤에 서서 병을 가능한 한 입술에 가까이 대고 기침을 하면서 가래를 즉시 병에 분리하도록 조언합니다. 이때 공기 흐름이 의료진에게서 멀어지도록 해야 합니다.
• 객담 채취가 완료되면, 의료진은 병뚜껑을 조심스럽게 닫고 채취된 객담의 양과 질을 평가해야 합니다. 그런 다음 병에 라벨을 붙이고 특수 상자에 담아 검사실로 운반합니다.

환자가 가래를 배출하지 않는 경우, 채취 전날 밤과 당일 이른 아침에 마시멜로 뿌리 추출물(뮤칼틴), 브롬헥신, 암브록솔 등의 거담제를 투여하거나, 가래 채취실에 설치된 장비를 이용하여 자극성 흡입제를 사용해야 합니다. 이렇게 채취된 가래는 보존할 필요가 없으며, 채취 당일 검사해야 합니다. 검사실에서 "거부"되는 것을 방지하기 위해 의뢰서에 특별히 기재해야 합니다.

특정 기관에서 미생물학 연구를 수행하지 않는 경우, 수집된 진단 검체는 냉장 보관하거나 보관 기간 동안 방부제를 사용하여 중앙에서 검사실로 전달해야 합니다. 검체는 쉽게 소독할 수 있는 운반 상자에 담아 검사실로 전달해야 합니다. 각 검체에는 적절한 라벨을 부착해야 하며, 전체 배치에는 작성 완료된 검체 동봉 양식이 포함되어야 합니다.

[ 29 ], [ 30 ], [ 31 ]

환자 검진의 방식 및 빈도

결핵에 대한 환자의 초기 진단 검사 시에는 의료진의 감독 하에 2~3일 동안 수집한 가래 중 최소 3부분을 검사해야 하며, 이를 통해 현미경 검사의 효율성이 높아집니다.

결핵에 대한 1차 검진은 의료 시스템의 모든 의료 및 진단 기관에서 실시해야 합니다. 최근에는 1차 검진의 효율성을 높이기 위해 임상 진단 검사실을 중심으로 소위 현미경 센터가 설립되었으며, 이 센터에는 전염병 예방을 위한 최신 현미경 및 장비가 갖춰져 있습니다.

결핵 예방 기관에서는 3일 이내에 객담이나 기타 진단 물질을 최소 3회 이상 검사하는 조사 체계를 사용합니다. 치료 기간 동안 집중 항암화학요법 단계에서는 미생물학적 검사를 최소 한 달에 한 번 정기적으로 실시합니다. 추적 관찰 단계로 넘어가면 검사 빈도는 2~3개월 간격으로 감소하며, 검사 횟수는 2회로 줄어듭니다.

폐외결핵 진단자료 수집의 특징

폐외 결핵의 병리학적 물질의 특징은 그 안에 결핵균의 농도가 낮다는 점인데, 이로 인해 주로 영양 배지에 파종하는 방법과 같은 더욱 민감한 미생물학적 연구가 필요합니다.

비뇨생식기 결핵의 경우, 소변은 검사에 가장 쉽게 접근할 수 있는 물질입니다. 소변 채취는 특별히 훈련된 간호사가 수행해야 합니다.

외부 생식기는 물과 비누 또는 묽은 과망간산칼륨 용액으로 세척합니다. 요도의 외부 개구부는 조심스럽게 처리합니다. 아침 소변의 중간 부분은 멸균 병에 채집합니다. 남성의 경우, 여성의 경우, 카테터를 사용합니다. 신우에서 채취한 소변은 하나 또는 두 개의 신장에 카테터를 삽입하는 동안 멸균 시험관에 채집합니다. 후자의 경우, 반드시 각 신장에서 따로 채집해야 합니다. 이 소변 중 소량을 원심분리하여 침전물을 검사합니다.

남성의 경우, 정자, 고환 천자, 전립선 분비물을 원심분리하여 침전물을 얻습니다. 남성 생식기 부위의 특정 부위에 국소화된 경우, 전립선 마사지는 결핵균이 포함된 분비물의 배출을 촉진할 수 있습니다.

여성의 월경혈은 흡입법이나 카프카 캡을 사용하여 채취합니다. 채취된 혈액은 증류수로 세척한 후 원심분리하여 적혈구를 제거합니다. 침전물을 검사합니다.

자궁경부에서 분비되는 분비물은 일종의 용기나 카프카 캡에 모아지는데, 즉 1~2ml의 병적인 물질이 축적되는 것이 바람직하다.

신장, 생식기, 생검, 자궁내막 스크래핑 등의 외과적 시술로 얻은 재료를 균질화합니다. 이를 위해 멸균 유발에 넣고 멸균 가위로 완전히 분쇄합니다. 얻어진 현탁액에 멸균 강모래를 질량과 동일한 양으로 첨가한 후, 등장성 염화나트륨 용액 0.5~1.0ml를 첨가하고, 등장성 염화나트륨 용액(4~5ml)을 첨가하여 묽은 덩어리가 될 때까지 분쇄합니다. 1~1.5분간 방치한 후 상층액을 검사합니다.

뼈와 관절의 결핵. 멸균 주사기로 채취한 천자(농양에서 나온 고름)를 멸균 용기에 담아 즉시 검사실로 옮깁니다. 멸균 등장성 염화나트륨 용액으로 미리 적신 멸균 피펫을 사용하여 고름 2~5ml를 채취하여 비드가 담긴 병에 옮기고, 등장성 염화나트륨 용액 2~3ml를 더 첨가합니다. 병의 마개를 닫고 진탕기에서 8~10분간 흔듭니다. 균질화된 현탁액을 검사합니다.

누공성 골관절 결핵의 경우, 누공에서 고름을 채취합니다. 고름이 많이 배출되면 시험관에 직접 채취합니다. 고름이 적게 배출되는 경우, 누공 경로를 멸균 등장성 염화나트륨 용액으로 세척하고, 세척액을 시험관이나 고름에 적신 탐폰 조각에 모아 검사를 위해 보냅니다.

뼈와 관절에 대한 외과적 시술 중 얻은 외과적 조직은 화농성 괴사성 종괴, 육아종, 흉터 조직, 뼈 조직, 활막 조직 및 기타 기질로 구성될 수 있습니다. 이러한 조직의 처리는 신장 결핵의 경우와 동일하게 수행됩니다.

혈전 생성을 방지하기 위해 침술 직후 3% 구연산나트륨 용액(비율 1:1)을 사용하여 활막액의 미생물학적 검사를 실시합니다.

림프절 결핵. 림프절 천자 시 채취한 고름은 농양에서 채취한 고름과 같은 방식으로 검사합니다. 수술적 처치 및 생검 시 채취한 림프절 조직은 다른 형태의 결핵과 마찬가지로 검사합니다.

결핵균에 대한 대변 연구는 양성 결과가 거의 나오지 않기 때문에 극히 드물게 수행됩니다.

[ 32 ], [ 33 ], [ 34 ], [ 35 ], [ 36 ]

결핵균의 현미경

객담 현미경 검사는 결핵이 의심되는 모든 경우에 사용해야 하는 비교적 빠르고 간단하며 저렴한 방법입니다. 또한, 이 연구는 항암 화학요법의 효과를 평가하고 배양 결과가 없을 경우 회복 또는 치료 실패를 확인하기 위해 수행됩니다.

현미경 검사에는 두 가지 방법이 사용됩니다.

• 직접 현미경 검사법은 진단 물질로부터 직접 도말 표본을 준비하는 방법입니다.
• 문화 연구를 위해 오염제거제로 처리한 물질로부터 준비한 퇴적물의 현미경 검사 방법.

첫 번째 방법은 현미경적 연구만 수행하는 실험실(일반 의료 네트워크의 임상 진단 실험실)에서 사용됩니다.

현미경 검사의 가장 좋은 결과는 진단 물질을 농축(예: 원심분리)하여 얻을 수 있습니다.

현미경으로 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)을 50% 확률로 검출하려면 1ml의 객담에 5,000개 이상의 미생물 세포가 포함되어야 합니다. 폐결핵 환자의 객담에는 일반적으로 상당수의 항산균이 포함되어 있어 세균경 검사를 통해 신뢰성 있게 검출할 수 있습니다. 한 환자의 객담 검체를 여러 개 검사하면 이 방법의 진단 민감도를 높일 수 있습니다. 세균경 검사 결과가 음성이라고 해서 결핵 진단을 배제할 수는 없습니다. 일부 환자의 객담에는 현미경으로 검출할 수 있는 것보다 적은 수의 결핵균이 포함되어 있기 때문입니다. 객담 도말 검사의 부적절한 준비 또한 세균경 검사 결과 음성의 원인이 될 수 있습니다.

도말표본에서 항산성 결핵균을 검출하는 가장 일반적인 방법은 지엘-닐슨 염색입니다. 이 방법은 왁스-지질층을 포함하는 막을 통해 카르볼-푹신이 미생물 세포 내로 침투하는 데 기반하며, 이때 가열과 페놀의 강력한 에칭 작용이 동시에 일어납니다. 이후 25% 황산 용액이나 3% 염산알코올 용액으로 도말표를 탈색하면 항산성이 없는 모든 구조가 탈색됩니다. 탈색된 도말표본은 0.3% 메틸렌블루 용액으로 염색합니다. 결핵균은 일반적인 아닐린 염료를 인식하지 못하기 때문에 항산성 결핵균은 라즈베리 레드로 염색되고, 다른 미생물과 세포 요소는 파란색으로 염색됩니다.

질-닐슨 염색법으로 염색된 도말을 검사하려면 90배 또는 100배 배율의 침지 대물렌즈와 7배 또는 10배 배율의 접안렌즈가 장착된 광학 쌍안 현미경을 사용합니다. 100개 시야를 검사하는데, 이는 도말에서 단일 결핵균을 검출하기에 충분합니다. 검사 결과가 음성인 경우, 확진을 위해 200개 시야를 추가로 검사하는 것이 좋습니다. 결과는 검출된 항산성 결핵균(AFB)의 수를 나타내며, 기록됩니다.

이 방법 외에도 형광염색법을 사용하여 발광 현미경을 통해 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 현미경 검사 효율이 10~15% 향상됩니다. 결핵균을 발광 염료(아우라민, 로다민 등)로 처리하면 이러한 물질이 미생물 세포의 왁스 유사 구조에도 결합합니다. 염색된 세포에 특정 스펙트럼의 자외선을 조사하면 검은색 또는 짙은 녹색 배경에 주황색 또는 밝은 빨간색으로 빛나기 시작합니다. 가시광선 이미지의 높은 밝기와 대비로 인해 현미경의 전체 배율을 4~10배까지 줄일 수 있어 시야가 넓어지고 표본 관찰 시간이 단축됩니다. 이와 함께, 시야 심도가 크게 향상되어 연구의 편의성이 향상될 수 있습니다.

형광 현미경을 사용하면 도말의 동일 부위를 관찰하는 데 Ziehl-Neelsen 염색법을 사용한 광학 현미경 검사보다 훨씬 짧은 시간이 소요됩니다. 현미경 검사자가 근무일에 약 20~25개의 도말을 관찰한다면, 형광 현미경을 사용하면 같은 시간에 60~80개 이상의 샘플을 검사할 수 있습니다. 숙련된 현미경 검사자들은 아우라민과 로다민 혼합물로 세포를 염색하는 것이 항산성 결핵균에 특이적인 작용을 한다는 것을 알고 있으며, 이 경우 황금색 막대 모양을 보입니다. 부생식물은 녹색으로 염색됩니다.

형광 현미경 방법의 또 다른 중요한 장점은 여러 불리한 요인, 특히 집중적인 화학 요법의 영향으로 산성 저항성을 잃은 변형된 항산균을 검출할 수 있는 능력으로, 따라서 지엘-닐슨 염색으로는 검출되지 않습니다.

형광현미경법의 단점은 현미경과 운영 비용이 상대적으로 높다는 것입니다. 그러나 중앙 집중형 실험실이나 기타 대규모 실험실에서 세 명의 실험실 기술자가 기존 현미경 세 대를 사용하는 일반적인 작업량을 초과하는 경우, 형광현미경 한 대를 사용하는 것이 더 저렴합니다.

세균경 검사법은 특이도가 상당히 높습니다(89~100%). 모든 현미경 검사법으로 얻은 양성 결과의 약 97%는 파종 결과를 통해 명확하게 확인됩니다.

병리학적 물질의 도말 표본을 현미경으로 검사한다고 해서 검출된 내산성 항산균의 종을 판별할 수는 없다는 점에 유의해야 합니다. 현미경 검사법은 제제 내 내산성 미생물의 존재 여부만을 판단할 수 있는데, 이는 자연계에 결핵균 복합체의 항산균과 형태적으로 유사한 비결핵성 내산성 미생물이 다수 존재하기 때문입니다.

현미경 검사 결과의 평가는 반정량적 단위로 수행됩니다.

다양한 현미경 방법의 결과를 비교하기 위해 경험적 계수를 도입합니다. 예를 들어, 형광 염료로 염색한 도말 결과와 광학 현미경(1000배 배율)으로 얻은 결과를 비교하려면 형광 현미경을 사용하여 검출된 항산성 항산균 수를 해당 계수로 나누어야 합니다. 현미경 배율 250배에서는 10배, 450배에서는 4배, 630배에서는 2배로 나눕니다.

폐외결핵의 현미경적 특징

직접 현미경 검사를 시행하며, 농축 후 Ziehl-Neelsen 염색이나 형광 염색으로 염색한 도말 표본도 현미경 검사를 시행합니다. 도말 표본의 직접 현미경 검사는 물질 내 결핵균 농도가 낮기 때문에 효과적이지 않으므로 농축 방법을 사용하는 것이 더 합리적입니다. 원심분리가 가장 효과적입니다. 생물학적 물질이 점성인 경우, 3000g의 원심력을 가진 고속 원심분리기와 차아염소산염 용액을 사용하여 물질의 균질화와 액화를 동시에 진행하는 원심분리를 시행합니다. 미세부유법(microflotation)과 같은 다른 농축 방법은 생물학적으로 유해한 에어로졸 형성으로 인해 현재 사용되지 않습니다.

[ 37 ]

결핵 진단을 위한 배양 방법

시딩법 또는 배양법은 도말 현미경보다 민감도가 높으며, 도말 현미경보다 여러 가지 장점이 있습니다. 검사 대상 물질에서 수십 개의 생존 가능한 항산균을 검출할 수 있으며, 높은 진단적 가치를 지닙니다. 특히 소량의 항산균을 배출하는 신규 진단 또는 치료 환자의 물질을 검사할 때 이러한 점이 중요합니다.

현미경 검사와 비교했을 때, 배양 연구는 결핵 환자 검출률을 15~25% 이상 높일 수 있을 뿐만 아니라, 질병이 아직 쉽게 치료될 수 있는 초기 단계에서 결핵을 확인할 수 있습니다. 배양 연구의 매우 중요한 장점 중 하나는 병원균 배양을 통해 약물 감수성, 병독성 및 기타 생물학적 특성과 관련하여 동정 및 연구할 수 있다는 것입니다.

재배 방법의 단점으로는 기간이 길다는 점(재료를 기다리는 기간이 10주에 달함), 비용이 많이 든다는 점, 진단 재료를 처리하는 과정이 복잡하다는 점 등이 있습니다.

진단재료의 파종전 처리 원칙

기존의 미생물학적 방법은 결핵 검사에 사용할 수 없습니다. 결핵균은 매우 느리게 성장하고, 대부분의 임상 검체에는 빠르게 성장하는 화농성 및 부패성 미생물과 진균이 포함되어 있기 때문입니다. 영양분이 풍부한 배지에서 이러한 미생물이 빠르게 성장하면 결핵균의 발달이 저해되어 결핵균을 분리할 수 없으므로, 진단 검체는 파종 전에 전처리해야 합니다. 또한, 환자의 호흡기에서 분비되는 결핵균은 일반적으로 다량의 점액에 둘러싸여 있어 농축이 어렵습니다. 따라서 객담 및 기타 유사 검체는 파종 전에 액화 및 살균 과정을 거쳐야 합니다.

모든 세제와 오염 제거제는 마이코박테리아에 다소 강한 독성을 나타냅니다. 처리 결과, 최대 90%의 마이코박테리아가 사멸할 수 있습니다. 마이코박테리아 개체군의 충분한 비율을 보존하기 위해서는, 빠르게 성장하는 화농성 및 부패성 미생물을 억제하는 동시에 재료에 존재하는 마이코박테리아의 생존력을 최대한 보존할 수 있는 순한 처리 방법을 사용해야 합니다.

재료, 균질성 및 오염 수준에 따라 다양한 오염 제거제가 사전 파종 처리에 사용됩니다.가래의 경우 - 4% 수산화나트륨 용액, 10% 인산삼나트륨 용액, 염화벤잘코늄 인산삼나트륨, 최종 NaOH 농도가 1%인 NALC-NaOH(N-아세틸-L-시스테인-수산화나트륨), 소변 및 기타 액체 물질의 경우 - 3% 황산 용액, 오염된 샘플, 지방 함유 물질의 경우 - 최대 5%의 옥살산 용액.또한 어떤 경우에는 효소와 계면활성제(세제)가 사용됩니다.Tween 및 일부 다른 세제를 사용하면 결핵균 세포의 사망이 줄어듭니다(40-50% 생존).그러나 이들은 액체 물질에만 사용할 수 있습니다.키트로 생산된 NALC-NaOH는 세계에서 가장 널리 사용됩니다.이 방법을 사용하면 결핵균 세포 집단의 85% 이상을 분리할 수 있습니다. 조직을 포함하는 고형 물질의 오염 제거는 균질화 과정에서 물질의 분산 정도를 예측하기 어렵기 때문에 더욱 어렵습니다. 예를 들어, 림프절 생검을 처리하는 과정에서 외래 세균총에 의한 오염 빈도가 증가하는 경우가 많습니다. 이 경우 1% 에토늄을 사용할 수 있습니다.

비균질 물질은 오염제거제를 첨가한 상태에서 유리 비드를 이용하여 균질화합니다. 액체 물질은 사전 원심분리 후 침전물만 처리합니다.

파종 및 부화 기술

예비 처리 후, 재료를 원심분리하여 항산균을 침전시키고 침전물 내 항산균 함량을 증가시킵니다("침전물 농축"). 생성된 침전물을 중화하여 고농도 영양 배지 또는 액체(반액체) 배지가 담긴 시험관 표면에 접종합니다. 남은 침전물에서 현미경 검사를 위한 도말 표본을 준비합니다. 시딩 기법은 진단 물질의 교차 오염을 방지해야 합니다.

미생물학 연구 결과에 대한 신뢰할 수 있는 임상적 해석을 위해서는 다음 규칙을 따라야 합니다. 즉, 동일한 진단 물질 샘플에서 현미경 연구와 배양 연구를 동시에 수행해야 합니다.

접종된 시험관을 37 ^° C의 항온조에 수평으로 2일 동안 놓아둡니다. 이렇게 하면 재료가 영양 배지에 더욱 균일하게 흡수됩니다. 2일 후, 시험관을 수직으로 옮기고 고무 또는 실리콘 마개로 밀봉하여 접종된 배지가 마르지 않도록 합니다.

^{작물은 10~12주 동안 37 °} C 의 항온조에 보관되며, 매주 정기적으로 검사를 받습니다. 각 검사 시 다음 항목들이 기록됩니다.

• 파종일부터 시각적으로 관찰 가능한 성장 기간
• 성장률(CFU 수)
• 배양물이 외래 미생물총이나 곰팡이에 오염된 경우(해당 시험관은 제거됨)
• 눈에 띄는 성장은 없습니다. 튜브는 다음 검사 때까지 온도 조절 장치에 그대로 두었습니다.

영양배지

마이코박테리아 배양에는 고체, 반액체, 액체 등 다양한 영양 배지가 사용됩니다. 그러나 알려진 영양 배지 중 모든 마이코박테리아 세포의 성장을 보장하는 특성은 없습니다. 따라서 효율을 높이기 위해 서로 다른 조성의 영양 배지 2~3개를 동시에 사용하는 것이 좋습니다.

세계보건기구(WHO)는 결핵균의 1차 분리 및 약제 감수성 판정을 위한 표준 배지로 로웬슈타인-옌센 배지를 권장합니다. 이 배지는 농후 난배지로, 세균학적으로 양성인 배양물을 파종한 후 20~25일째에 결핵균 증식을 유도합니다. 세균학적으로 음성인 배양물을 파종하는 경우 배양 기간이 더 길어집니다(최대 10~12주).

우리나라에서는 ER Finn이 제안한 Finn-II 계란 배지가 널리 보급되었습니다. 이 배지는 L-아스파라긴 대신 글루탐산나트륨을 사용하여 마이코박테리아의 아미노산 합성을 위한 다른 경로를 활성화한다는 점에서 차이가 있습니다. 이 배지에서는 생장이 다소 일찍 시작되며, 마이코박테리아 분리 빈도는 Lowenstein-Jensen 배지보다 6~8% 더 높습니다.

폐외 결핵의 세균학적 진단 효율을 높이기 위해 영양 배지 복합체에 변형 Finn-II 배지를 포함하는 것이 좋습니다. 성장을 촉진하기 위해 0.05% 티오글리콜산나트륨을 Finn-II 영양 배지에 추가로 첨가하여 산소 농도를 낮춥니다. 지질 과산화로 인한 독성 생성물로부터 마이코박테리아의 효소계를 보호하기 위해 항산화제인 α-토코페롤 아세테이트를 0.001 μg/ml의 농도로 Finn-II 영양 배지에 첨가합니다. 진단 물질은 표준 방법을 사용하여 접종합니다.

러시아의 항결핵 연구실에서는 농축 영양 배지의 다른 변형도 사용합니다. G. G. Mordovsky가 제안한 영양 배지 "Novaya", VA. Anikin이 개발한 영양 배지 A-6 및 A-9 등이 있습니다.

화학요법 중에는 미생물 세포의 다양한 대사 체계가 손상되기 때문에 일부 결핵균 집단은 기존의 영양 배지에서 정상적으로 발달할 수 있는 능력을 상실하고 삼투압이 균형 잡힌(반액체 또는 액체) 영양 배지가 필요합니다.

진단물질 배양 결과의 평가 및 기록

일부 항산균 균주와 유형은 성장 속도가 느려 90일째에도 성장이 나타날 수 있습니다. 이러한 배양 횟수는 적지만, 이로 인해 파종물을 2.5~3개월 동안 항온조에 보관해야 합니다.

결핵균의 독성 배양액은 일반적으로 고형 계란 배지에서 다양한 크기와 모양을 가진 R형 집락으로 자랍니다. 집락은 건조하고 주름지며 상아색을 띠고 약간 색소가 침착되어 있습니다. 다른 배지에서는 결핵균 집락이 더 촉촉할 수 있습니다. 항암 화학요법 후 또는 치료 중에 촉촉하게 성장한 매끈한 집락(S형)이 분리될 수 있습니다.

배양물을 분리할 때, 결핵성 항산균과 비결핵성 항산균, 항산성 부생균을 구별하기 위해 일련의 특수 연구를 실시합니다.

Ziehl-Neelsen 염색법으로 염색된 성장한 집락의 도말 표본을 의무적으로 현미경으로 검사한 후 양성으로 판정합니다. 결핵균이 증식한 경우, 밝은 붉은색 간상균이 도말 표본에서 단독 또는 군집하여 펠트 또는 끈 모양의 덩어리를 형성하며 발견됩니다. 특히 장기간 항암화학요법을 받은 환자에서 분리한 젊은 배양액에서 결핵균은 뚜렷한 다형성을 보이며, 균사체와 유사한 짧고 거의 구형이거나 길쭉한 변종과 간상 형태가 함께 나타납니다.

결핵균 증식 강도는 다음 체계에 따라 지정합니다.(+) - 시험관 내 1-20 CFU(박테리아 배설량 낮음); (++) - 시험관 내 20-100 CFU(박테리아 배설량 보통); (+++) - 시험관 내 100 CFU 이상(박테리아 배설량 많음). 결핵의 실험실 진단에서는 특정 방법으로 결핵균이 검출되었는지 여부를 나타내는 답변만으로는 충분하지 않습니다. 또한 결핵균 집단의 양과 특성, 구성 및 특성에 대한 자세한 정보를 얻는 것이 필요합니다. 이러한 데이터를 통해 과정 상태를 정확하게 해석하고 전략을 계획하며 신속하게 치료를 조정할 수 있습니다.

최근, 다양한 성장 첨가제를 첨가한 한천 기반 영양 배지와 특수 가스 혼합물을 사용하여 마이코박테리아의 성장을 촉진하는 방법이 제안되었습니다. 이러한 배지에서 마이코박테리아를 성장시키기 위해 배양 중 이산화탄소 함량이 4~7% 증가된 환경을 조성합니다. 이를 위해 특수 CO2 배양기가 사용됩니다 _. 그러나 자동화된 마이코박테리아 배양 시스템인 MGIT-BACTEC-960과 MB/Bact가 가장 큰 발전을 이루었습니다.

이러한 시스템 중 하나는 MGIT(항산균 증식 지시관) 시스템으로, 첨단 기술로 개발된 결핵의 신속한 세균학적 진단 및 1차 약제와 일부 2차 약제에 대한 항산균 감수성 확인을 위해 설계되었습니다. MGIT는 VASTEC-960 장치의 일부로 사용하도록 설계되었습니다. 미생물은 변형된 Middlebrook-7H9 배지를 기반으로 한 액체 영양 배지가 담긴 특수 시험관에서 배양됩니다. 항산균의 증식을 촉진하고 외래 미생물총의 증식을 억제하기 위해 MGIT 증식 보조제와 PANTA 항균제 혼합물을 사용합니다.

미생물의 성장은 광학적으로 기록됩니다. 이는 마이코박테리아가 성장하는 동안 산소를 소비할 때 발생하는 형광을 기반으로 합니다. 산소 의존성 형광염료는 특수 시험관 바닥에 담겨 있으며 실리콘 층으로 덮여 있습니다. 마이코박테리아의 증식은 시험관 내 산소량과 농도 감소로 이어지고, 이는 형광을 증가시킵니다. 형광은 시험관에 자외선을 조사하면 눈에 띄게 나타나고, VASTES-960 장치에 내장된 광센서에 의해 자동으로 기록됩니다. 발광 강도는 성장 단위(GU)로 기록됩니다. 성장 데이터는 컴퓨터에 자동으로 입력되어 저장할 수 있습니다. 성장 곡선의 컴퓨터 분석은 비결핵균을 포함한 다양한 마이코박테리아 풀의 존재에 대한 정보를 제공할 수 있으며, 마이코박테리아의 성장 특성을 평가하는 데에도 도움이 됩니다.

이러한 시스템 도입으로 결핵균 증식 시간이 크게 단축되어, VASTEC-960에서는 평균 11일, MB/Bact에서는 평균 19일이 소요되는 반면, 표준 고농도 영양 배지에서는 33일이 소요되었습니다. 이러한 시스템에는 고도로 숙련된 인력이 필요하다는 점에 유의해야 합니다. 액체 배지에 재료를 파종할 때는 필연적으로 Lowenstein-Jensen 배지에 파종해야 하는데, 이 배지는 다른 배지에서 결핵균이 증식하지 않을 경우 예비 배지 역할을 합니다.

[ 38 ], [ 39 ], [ 40 ], [ 41 ], [ 42 ], [ 43 ]

항산균의 약물 감수성 결정

항결핵제에 대한 항산균의 스펙트럼과 감수성 정도를 파악하는 것은 임상적으로 매우 중요할 뿐만 아니라, 약제내성 결핵 확산에 대한 역학적 평가에도 중요합니다. 또한, 약제내성 모니터링을 통해 항결핵 프로그램 전체의 효과를 평가할 수 있으며, 이는 항결핵 조치의 모든 구성 요소의 성과를 보여주는 중요한 지표가 됩니다.

약물 감수성 검사의 빈도 및 시기:

• 치료를 시작하기 전에 치료 전략과 전술을 결정하기 위해:
• 환자의 다양한 물질(가래, BAL, 소변, 삼출물, 뇌척수액 등)에서 배양물을 분리할 때 분리된 모든 균주를 검사합니다.
• 임상적, 방사선학적 역학이 없는 집중 치료 단계가 끝날 때:
• 다음의 경우 치료 계획을 변경해야 합니다.
  • 가래 음성 반응이 없음
  • 객담 음성 후 재배양;
  • 도말 검사에서 항산균(AFB) 양이 초기 감소 후 급격히 증가하는 현상. 결핵 환자의 검체에서 다양한 약물 감수성을 가진 결핵균이 분리된다는 것은 잘 알려진 사실입니다. 항결핵제에 대한 균주의 감수성은 약물의 종류, 내성 발생 정도, 빈도 및 속도에 따라 다를 수 있습니다.

결핵균의 약물 내성 정도는 확립된 기준에 따라 결정되는데, 이 기준은 내성의 임상적 의의에 초점을 맞추고 약물의 항결핵 활성, 약물동태학, 병변 농도, 최대 치료 용량 등에 따라 달라집니다.

현재 결핵균의 약물 감수성 결정은 미생물학적 방법을 사용하여 수행됩니다.

• 절대 농도(고체 또는 액체 영양소 배지에서의 희석 방법),
• 크기,
• 저항계수.

일반적으로 내성은 결핵균 군집의 육안 관찰을 통해 나타나지만, 결핵균 세포 분열 초기 단계에서 발색 반응을 통해 성장을 유도하는 방법도 있습니다. 이러한 방법을 사용하면 검사 시간을 3-4주에서 2주로 단축할 수 있습니다.

WHO 화학요법 위원회가 권장하는 절대농도법은 러시아에서 통일된 방법으로 널리 사용되고 있습니다. 방법론적 관점에서 가장 간단하지만, 높은 표준화와 실험실 절차의 정밀성이 요구됩니다. 약물 감수성 검사는 항결핵제로 개질된 영양 배지가 담긴 시험관 세트로 구성됩니다. 이 세트는 사용된 각 약물의 농도가 다른 시험관 2~3개, 약물이 없는 배지가 담긴 대조 시험관 1개, 그리고 비결핵성 항산균의 증식을 검출하기 위한 살리실산나트륨 1000μg/ml 또는 파라니트로벤조산 500μg/ml이 담긴 시험관 1개로 구성됩니다.

배지를 준비하려면 변형된 로웬슈타인-옌센 배지(전분 없음)를 사용하여 플라스크에 붓습니다. 각 플라스크에 항결핵제 희석액의 일정량을 넣습니다. 플라스크 내용물을 완전히 혼합한 후 시험관에 붓고 85°C의 온도에서 40분 동안 기울여 응고시킵니다. 자동 온도 조절 기능이 있는 전기 응고기를 사용하여 배지를 응고하는 것이 좋습니다. 항결핵제가 포함된 배지

첫 번째 줄은 2~4°C의 냉장고에 1개월 동안 보관할 수 있으며, 두 번째 줄의 약물은 최대 2주까지 보관할 수 있습니다. 약물이 포함된 배지를 실온에서 보관하는 것은 허용되지 않습니다. 항결핵제 용액을 제조할 때는 약물의 활성을 고려하여 약물의 비특이적 부분의 분자량, 순도 등을 조정하여 농도를 계산합니다. 약물 감수성을 확인하기 위해서는 화학적으로 순수한 물질만 사용합니다.

이 방법의 원리는 항결핵제 농도를 측정하여 항결핵균 개체군의 상당 부분의 성장을 억제하는 것입니다. 이 방법은 정확하게 수행될 경우 신뢰성이 높습니다.

시험을 수행하기 전에 분리된 결핵균 배양액에 외래 미생물총이 포함되어 있지 않은지 확인해야 합니다. 0.9% 염화나트륨 용액에 배양된 결핵균으로부터 1ml(광학 탁도 표준 5단위)에 5억 개의 미생물체가 포함된 균질한 현탁액을 제조합니다. 생성된 현탁액을 0.9% 염화나트륨 용액(1:10)으로 희석하고 현탁액 0.2ml를 영양 배지 세트의 각 시험관에 첨가합니다. 접종한 시험관을 37°C의 항온조에 넣고 2~3일 동안 수평으로 유지하여 영양 배지의 경사면에 결핵균 현탁액이 균일하게 접종되도록 합니다. 그런 다음 시험관을 수직 위치로 옮겨 3~4주 동안 배양합니다. 결과는 3~4주 후에 기록합니다.

영양배지에서 임상 물질로부터 병원균을 분리하는 데 최소 1~1.5개월이 걸리므로, 이 방법을 이용한 약물 감수성 판정 결과는 물질 접종 후 2~2.5개월이 지나야 얻을 수 있습니다. 이는 이 방법의 주요 단점 중 하나입니다.

항산균 약물 감수성 검사 결과는 특정 기준에 따라 해석됩니다. 고체 배지에서, 약물이 포함된 시험관에서 배양된 항산균 집락 수가 20개를 넘지 않고, 약물이 포함되지 않은 대조 시험관에서 풍부하게 증식하는 경우, 해당 배양물은 배지에 포함된 약물 농도에 민감한 것으로 간주됩니다. 20개 이상의 집락이 있는 경우에만 해당 배양물이 특정 농도에 내성을 갖는 것으로 간주됩니다. 실제로 시험관에서 20 CFU에 가까운 농도로 증식한 경우, 임상 지표의 불분명한 역학을 설명할 수 있으므로 이 경우 민감도 또는 내성이 경계선에 있음을 임상 부서에 알려야 합니다.

다양한 제제의 경우, 마이코박테리아 개체군의 임계 비율의 증식이 관찰되는 특정 농도가 설정됩니다. 이러한 농도를 "임계" 농도라고 합니다. 해당 제제가 포함된 영양 배지에서 마이코박테리아 개체군의 증식 정도는 안정성의 기준으로 사용됩니다.

국내 결핵학 실무에서는 약제 내성을 판단할 때 단순히 임계 농도만을 결정하는 데 국한되지 않습니다. 이는 병원균의 약제 내성 수준에 대한 정의가 확대됨에 따라 임상의가 약제 조합의 증강 효과에 대한 지식을 활용하여 화학요법 전략을 더욱 정확하게 수립하고, 교차 내성을 예측하거나, 사용된 항결핵제 군 중 더 효과적인 약제를 사용할 수 있게 되기 때문입니다.

절대 농도법은 가장 간단하지만, 구현 과정에서 발생할 수 있는 오류에 가장 취약합니다. 특히 2차 약물의 민감도를 측정할 때 더 신뢰할 수 있으며, 러시아 외 지역에서도 널리 사용되는 비율법은 절대 농도법의 단점을 고려하지만, 구현에 더 많은 노력이 필요합니다.

이 방법은 절대농도법과 매우 유사합니다.약물이 담긴 시험관을 준비하는 것은 절대농도법과 동일합니다.그러나 결핵균 현탁액의 종자 투여량을 10배 줄여 에탐부톨, 프로티오나미드, 카프레오마이신과 같은 약물에 대한 일부 결핵균 균주의 자연 내성 빈도를 제거합니다.대조군으로 시험관과 동일한 종자 투여량을 가진 2개 또는 3개의 튜브를 10배와 100배로 연속 희석하여 사용합니다.내성 기준은 시각적으로 관찰된 결핵균 성장의 비율입니다.1차 약물의 경우 내성 기준은 초기 집단의 1% 초과 성장이고, 2차 약물의 경우 선택한 임계 농도에 따라 초기 집단의 1% 또는 10% 초과 성장입니다.

1997년, WHO와 국제결핵연합의 항결핵제 내성 검출 실무 그룹은 이러한 기준을 조정하여, 다음과 같은 농도의 로웬스타인-옌센 계란 배지에서 자라는 항산균을 내성균으로 간주할 것을 제안했습니다.

• 디히드로스트렙토마이신 - 4 μg/ml;
• 이소니아지드 - 0.2 µg/ml:
• 리팜피신 - 40mcg/ml:
• 에탐부톨 - 2mcg/ml.

2001년에 다음의 2차 약물에 대한 임계 농도가 제안되었습니다(임계 비율 1%).

• 카프레오마이신 - 40mcg/ml;
• 프로티오나미드 - 40mcg/ml;
• 카나마이신 - 30 μg/ml;
• 비오마이신 - 30 μg/ml;
• 사이클로세린 - 40mcg/ml;
• 아미노살리실산 - 0.5mcg/ml;
• 오플록사신 - 2mcg/ml.

성장 결과는 예비적으로 4주 후에 평가되고, 최종적으로는 6주 후에 평가됩니다.

현대 결핵 화학요법에 널리 사용되는 피라지나미드에 대한 약물 감수성을 측정하기 위한 권장 임계 농도는 200μg/ml입니다. 그러나 이 약물의 항균 활성은 기술적으로 유지하기 어려운 산성 환경(pH <6)에서만 나타나기 때문에 고체 영양 배지에서 이 약물에 대한 약물 내성을 측정하는 일반적으로 받아들여지는 방법은 아직 없습니다. 또한, 많은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 임상 배양물은 산성 환경의 계란 배지에서 배양하는 것을 꺼립니다.

결핵균의 약제 감수성 측정 결과의 질을 평가하기 위해서는, 로웬슈타인-옌센 배지의 새로운 배치마다 표준 박물관 균주 H37Rv의 감수성을 동시에 측정하는 것이 권장됩니다. 또한, 재현성이 높고 정확하게 해석된 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 미생물학적 기준을 충족해야 합니다. 여기에는 결핵 결핵균 배양액의 생존력, 균질한 현탁액 및 현탁액 제조 기준, 결핵 결핵균 배양액 선택 기준, 그리고 선택된 세균 덩어리의 대표성 등이 포함됩니다. 세균 배설이 매우 불량하면 약제 내성 측정의 신뢰성이 떨어집니다.

최근 자동화 시스템을 이용한 약물 감수성 측정 방법이 유망한 것으로 평가받고 있습니다. 이 분야에서 가장 발전된 방법은 VASTEC MGIT-960 기반 개발입니다. 이 경우, 결핵균의 약물 감수성은 변형 비율법을 기반으로 측정합니다. 측정 과정에서 대조군과 약물이 담긴 시험관에서 결핵균의 성장 속도를 비교합니다. 스트렙토마이신, 이소니아지드, 리팜피신, 에탐부톨에 대한 감수성을 측정하기 위해 SIRE 키트에 포함된 농축 첨가제와 항생제가 사용됩니다. 피라지나미드에 대한 감수성을 측정하기 위해 PZA 키트가 사용됩니다. 검사 과정에서 약물이 담긴 시험관에 결핵균 현탁액을 접종하고, 피라지나미드를 제외한 모든 약물의 현탁액을 100배 희석한 대조군 시험관에 접종합니다. 피라지나미드의 경우 현탁액 희석 비율이 10배입니다. 안정성 기준은 대조군에서 마이코박테리아 증식량이 400 GU에 도달했을 때 마이코박테리아 증식 지표가 100 GU인 경우입니다("마이코박테리아 분리를 위한 배양 방법" 참조). 결과는 자동으로 기록 및 해석되며, 입력하거나 선택한 프로그램에 의해 설정됩니다.

액체 영양 배지가 담긴 시험관의 최종 농도를 임계 농도로 사용합니다. 현재 1차 약제와 일부 2차 약제 모두에 대한 임계 농도가 개발되었습니다. 결핵균의 사이클로세린과 아미노살리실산에 대한 감수성 측정은 계란 영양 배지에서만 수행된다는 점에 유의해야 합니다.

설명된 시스템을 사용하기 위한 상세한 프로토콜은 분리 배양물(농축 영양 배지 사용)과 MGIT 시험관에서 항산균의 일차 증식을 이용한 약물 감수성 검사를 모두 가능하게 합니다. 후자는 배양 연구 수행에 필요한 시간을 크게 단축하여, 기존 방법은 3개월이 지나야 비로소 결과를 얻을 수 있었던 반면, 결핵 항산균 배양에 대한 완전한 결과(약물 감수성 정보 포함)를 채취 후 3주 이내에 얻을 수 있습니다. 환자가 집중 치료 단계에 있는 경우, 적시에 결과를 얻을 수 있으므로 상대적으로 높은 연구 비용을 상쇄할 수 있습니다.

[ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ], [ 48 ], [ 49 ], [ 50 ]

결핵균의 분화

사용되는 영양 배지가 엄격하게 선택적이지 않다는 점을 고려할 때, 분리된 항산균의 후속적인 감별은 필수적인 것으로 간주됩니다. 항산균 감별의 필요성은 이 속(genus)의 대표균들이 유발하는 여러 병리학적 과정의 특징, 즉 결핵과 항산균증의 다양한 경과 및 결과, 일부 항결핵제에 대한 자연 내성 존재 때문입니다.

비결핵성 항산균과 M. tuberculosis 복합체의 항산균을 일차적으로 식별하는 것은 다음과 같은 특징에 따라 수행되는 것으로 알려져 있습니다. 즉, 영양분이 풍부한 배지에서의 성장 속도, 색소 형성, 집락 형태, 산 저항성 및 성장에 적합한 최적 온도입니다.

불행히도 M. tuberculosis 복합체의 항산균과 다른 항산균을 확실하게 구별할 수 있는 단일 실험실 방법은 없습니다. 그러나 위에 설명한 징후와 아래에 제시된 여러 생화학적 검사 결과를 조합하면 최대 95%의 확률로 M. tuberculosis 복합체의 항산균을 식별할 수 있습니다.

결핵균 복합체(결핵균, 우형결핵균, 우형결핵균 BCG, 아프리카눔균, 미크로티균, 카네티균 등)에 속하는 결핵균을 천천히 자라는 비결핵성 결핵균과 구별하기 위해 다음과 같은 징후가 있는지 확인하기 위한 기본 생화학적 검사를 실시합니다.

• 니코틴산을 생성하는 능력(니아신 검사):
• 질산환원효소 활동
• 열안정성 카탈라아제
• 살리실산나트륨(1 mg/ml)이 함유된 배지에서 성장.

추가 시험으로, 500 μg/ml 파라니트로벤조산 또는 5% 염화나트륨을 함유한 배지에서의 성장 시험을 사용할 수도 있습니다.

많은 세균학 실험실에서는 실험실의 제한된 역량과 전문가의 방법론적 능력으로 인해 복잡한 수준에서만 이러한 미생물을 식별합니다.

실제로 대부분의 경우, 결핵균과 우형 결핵균을 감별하기 위해서는 니아신, 질산 환원효소, 피라진아미다제, 그리고 2 μg/ml 티오펜-2-카르복실산 히드라지드가 함유된 배지에서 증식 검사를 시행하는 것으로 충분합니다. 결핵균 복합체의 결핵균은 다음과 같은 특징을 보입니다.

• 성장이 느림(3주 이상)
• 성장 온도는 35-37 ^o C입니다.
• 색소의 부재(상아색)
• 뚜렷한 산성 변색
• 양성 니아신 검사 결과
• 양성 질산환원효소 검사
• ^{열안정성 카탈라아제(68 o} C) 가 없음.
• 다음을 포함하는 Lowenstein-Jensen 배지에서 성장이 부족함:
  • 1000 µg/ml 살리실산나트륨,
  • 500mcg/ml 파라니트로벤조산,
  • 5% 염화나트륨:
• 1-5 μg/ml 티오펜-2-카르복실산이 존재하는 환경에서 성장합니다.

결핵이나 항산균증과 관련된 HIV/AIDS 사례 등록 빈도가 증가함에 따라 분리된 항산균의 감별 진단의 중요성이 크게 높아질 것입니다. 현재로서는 지역 실험실들이 이러한 규모의 연구를 제대로 수행할 준비가 되어 있는지에 대한 확실한 확신이 없습니다.

[ 51 ], [ 52 ], [ 53 ], [ 54 ], [ 55 ], [ 56 ], [ 57 ], [ 58 ]

결핵의 면역학적 진단

결핵이나 항산균 면역 반응 모델에서 특이적으로 처음 발견된 여러 가지 보편적 현상, 제제, 그리고 면역학적 검사가 있습니다. 여기에는 BCG와 투베르쿨린, 피부 DST(투베르쿨린 검사 - 피르케 및 망투 반응), 그리고 감작된 동물에게 투베르쿨린을 피하 투여했을 때 나타나는 반응(코흐 현상)이 포함됩니다. 감염성 질환에서 발견된 최초의 항체 중 일부는 결핵에서도 발견되었습니다. 물론, 항결핵 면역 기전과 그 유전적 조절에 대한 이해가 깊어질수록 면역에 영향을 미치는 면역학적 방법 및 제제를 결핵학의 실질적인 문제 해결에 더욱 폭넓게 활용할 수 있습니다.

현재 가장 중요하고 복잡한 실무적 문제는 인구 집단의 대량 검진 과정에서 결핵을 검출하는 것으로 여겨집니다. 그러나 (제한된 자료를 바탕으로) 수많은 "성공" 보고에도 불구하고, 이러한 목적에 적합한 ("누구나" 재현 가능한) 면역학적 방법이나 약물은 없습니다.

면역학적 방법, 특히 혈청학적 연구(항원, 항체 결정)와 결핵 유발 검사는 임상 실무에서 널리 사용됩니다.

신체의 다양한 환경에서 항원과 항체를 결정하는 혈청학적 방법은 감별 진단에 사용되는 면역학적 연구 중에서 가장 널리 사용됩니다.

결핵균 항체 측정의 특이성은 면역 분석에 사용된 항원에 따라 달라집니다. 상당수의 항원이 제시되었는데, 그중 첫 번째 항원은 투베르쿨린 PPD입니다.

• 배양액으로부터 얻은 PPD 및 기타 복합 제제
• 초음파 분해제
• 트리톤 추출물 및 기타 복잡한 세포벽 제제
• 5-항원(다니엘)
• 60-항원(Coccito);
• 리포아라비노만난;
• 코드 인자(트레할로스-6,6-디-미콜레이트)
• 페놀 및 기타 당지질
• 리포다당류
• 피브로넥틴 결합 항원
• 단백질(대부분 재조합) 81, 65, 38, 34, 30, 19, 18, 16, 15.12 KDA 등

러시아와 외국 과학자들의 수년간의 연구 결과, 결핵 항체 형성의 주요 양상과 혈청학적 진단의 효과가 밝혀졌습니다. 항원이 복잡할수록 검사의 민감도는 높아지고 특이도는 낮아집니다. 특이도는 결핵균 및 비결핵성 항산균 감염 여부, BCG 백신 접종 여부 등에 따라 국가마다 다릅니다. 소아의 경우, 혈청학적 진단의 정보성은 성인보다 낮습니다. 1차 결핵(더 자주 소아)에서는 IgM 검사가 더 유용하고, 2차 결핵에서는 IgG 검사가 더 유용합니다. HIV 감염자의 경우, 항체 검사에서 혈청학적 진단의 정보성은 감소합니다. 항체 검사의 효과는 여러 "임상적 요인"에 따라 달라집니다. 즉, 검사 과정의 활성도(항산균 "분리" 유무, 충치 발생 유무, 침윤 정도), 검사 유병률, 검사 기간입니다.

효소면역측정법(EIA)의 민감도는 약 70%입니다. 이 연구의 효과성이 부족한 것은 특이도가 낮기 때문입니다. 이전에는 고위험군, 특히 결핵 후 폐에 변화가 있는 사람들을 대상으로 혈청학적 선별 검사를 시행하는 것이 고려되었습니다.

ELISA의 특이성을 높이기 위해 유전공학을 통해 얻은 항원(ESAT-6 등, 위 참조)을 포함하여 더욱 특이적인 항원이 모색되고 있습니다. 엄격하게 특이적인 항원(38 kDa, ESAT)을 사용하면 특이성은 증가하지만 분석 민감도는 크게 떨어집니다. ELISA(Pathozyme ELISA 키트와 같은 실험 실험실 검사 시스템)와 함께 측면 여과(Mycodot)가 포함된 면역크로마토그래피 키트와 검사 결과를 시각적으로 평가하는 다른 유사한 검사(멤브레인 도트 분석)도 제공됩니다. 이러한 검사를 수행할 때 분석에는 10~30분이 소요되며 특수 장비가 필요하지 않고 결과의 시각적 평가가 필요하므로 어느 정도 주관적입니다. 이러한 방법은 기존 ELISA와 거의 동일한 민감도 및 특이도 특성(각각 70% 및 90~93%)을 갖습니다.

면역 분석법은 결핵 감별 진단, 특히 폐외 결핵 진단에 사용되는 여러 방법 중 하나로서 중요한 가치를 지닙니다. ELISA법은 뇌척수액을 검사하여 결핵성 수막염을 진단하는 데 가장 효과적입니다. 이 경우 분석의 민감도는 80~85%, 특이도는 97~98%입니다. 결핵성 포도막염 진단 시 눈물에서 결핵균 항체를 검출하는 것이 효과적이라는 연구 결과도 있습니다.

시험관 내 감마 인터페론 합성 유도

감마 인터페론(IFN-γ)은 대식세포의 효소 체계를 활성화시켜 특정 면역 보호 효과를 나타냅니다. 감작된 T 림프구에 의한 IFN-γ 합성 유도는 마이코박테리아 항원과의 상호작용에 의해 발생합니다.

결핵 PPD와 유전공학으로 얻은 특정 항원, 특히 ESAT-6 항원(분자량 6 kDa의 초기 분비 항원)과 CFP-10(배양 여과 단백질, 10 kDa)이 항원으로 사용됩니다. 유전자 조작 또는 재조합 항원은 BCG 백신 및 기타 결핵균 세포에는 존재하지 않습니다. 결핵을 사용할 경우 IFN-γ 유도 검사 결과는 결핵 피부 검사 결과와 유사합니다(직접적인 상관관계). 유전자 조작 항원을 사용할 경우 검사 결과가 더 특이적이며 이전 BCG 백신 접종 여부에 따라 달라지지 않습니다. 결핵 감염과 접촉하지 않은 백신 접종자를 검사할 경우 검사의 특이도는 99%입니다. 결핵 환자에서 검사의 민감도는 81~89%입니다.

혈액에서 분리한 전혈 세포 또는 단핵구를 체외에서 결핵균 항원과 함께 단기간 배양한 후, IFN-γ 농도를 측정하거나 IFN-γ를 합성하는 T 림프구 수를 세는 방법을 기반으로 검사 및 진단법이 개발되었습니다. 시험관에서 합성된 인터페론의 농도는 IFN-γ에 결합하는 단일클론 항체를 이용한 ELISA법으로 측정합니다. 그런 다음, 표준 IFN-γ를 보정하여 시험관 또는 플레이트 웰에서 IFN-γ 농도를 측정합니다.

Elispot 검사에서는 IFN-γ를 합성하는 T 세포의 수를 IFN-γ에 대한 항체로 코팅된 접시 표면에서 센다.

미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받은 체외 인터페론-감마 유도 진단법 개발자들은 이 검사가 잠복 결핵 감염과 활동성 결핵을 구분할 수 없다고 주장합니다. 따라서 감염률이 높은 지역에서는 이 검사가 직접적인 진단적 가치가 없습니다. 그러나 우리나라에서는 소아의 결핵 감염과 백신 접종 후 알레르기를 구분하고, 치료 중 특이 면역 수준을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

현재, 특정 결핵 항원에 의한 IFN-γ 합성 유도를 시험관 내에서 확인하기 위한 국내 시험 시스템이 연구되고 있습니다.

결핵의 면역 상태 및 경과, 면역 교정

결핵을 치료하는 동안 사람의 항원혈증과 면역 체계 상태에 변화가 발생합니다.

삼출물과 조직의 변화에 대한 데이터는 대체로 상반됩니다. 충분히 타당한 근거를 가지고 언급할 수 있는 유일한 사실은 결핵성 육아종은 일반적으로 상당수의 활성화된 T 림프구를 함유하고 있다는 것입니다.

인간의 결핵 치료에 있어서 면역학적 메커니즘의 역할을 이해하는 데 필요한 두 가지 사항을 더 살펴보는 것이 좋습니다.

• AIDS 환자는 다중 약물 내성을 가질 확률이 특히 높습니다.
• 다중 약물 내성이 있는 경우(그리고 HIV 감염이 없는 경우), 면역 장애(주로 T세포 면역)가 특히 심각합니다.

결핵의 경우 다양한 면역 교정 방법이 널리 사용됩니다. 우선, 이는 주로 T세포 면역과 단핵구 식세포 시스템(흉선 호르몬, 이소폰, 리코피드, 폴리옥시도늄 등)에 작용하는 약물, 그리고 전체(약화된) 항산균과 그 구성 요소에 작용하는 약물입니다.

결핵의 분자생물학적 진단

감염성 질환 진단에 사용되는 분자생물학적 방법은 주로 박테리아 및 바이러스 병원체의 유전체 물질을 조작하여 특정 유전 물질(특정 병원체 종 또는 균주에 특이적인 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 절편)을 식별하는 방법을 포함합니다. 특정 약물에 대한 병원체의 민감도를 결정하는 유전자의 특정 DNA 서열을 분석하고, 병원체 특정 유전자의 기능적 활성을 분석합니다. 1985년 캐리 멀리스(1989년 노벨상 수상자)가 중합효소 연쇄 반응을 발견한 이후, 분자생물학적 방법은 다양한 박테리아 및 바이러스 감염의 진단 및 모니터링 분야에서 과학 연구 및 실제 적용 분야에서 널리 활용되었습니다.

중합효소 연쇄 반응법의 원리와 능력

PCR은 시험관에서 몇 시간 만에 병원균 DNA 단편인 뉴클레오타이드 서열을 수백만 배로 증폭(증식)시킬 수 있습니다. 단일 DNA 사슬이 존재하는 환경에서 반응을 수행함으로써 분석의 민감도가 매우 높아집니다.

DNA 사슬의 특정 부분의 뉴클레오타이드 서열은 미생물의 유전적 고유성을 결정하며, 이는 PCR의 높은 특이성을 설명합니다.

결핵균의 특성을 검출하고 연구하는 데 있어서 이 방법이 중요한 이유는 미생물의 생물학적 특성 때문입니다. 이 미생물은 성장 속도가 매우 느립니다. 결핵균을 배양하는 동안 DNA가 두 배가 되는 시간은 12~24시간입니다.

PCR 방법의 원리는 증폭입니다. 시험관 미세부피에서 특정 DNA 서열의 일부를 수백만 배로 증폭하고 다음 세 가지 반응 단계를 주기적으로 반복하는 것입니다. 각 단계는 서로 다른 온도 영역에서 진행됩니다.

• 1단계 - 가열 시 이중 가닥 DNA가 변성되고 사슬이 갈라짐
• 2단계 - 증폭을 위해 선택된 엄격히 특정한 DNA 단편의 사슬의 끝 부분과 프라이머(프라이밍 올리고뉴클레오타이드)의 상보적 결합(하이브리드화)
• 3단계 – 열안정성 DNA 중합효소를 사용하여 DNA 단편 사슬 완성.

증폭을 위해 시험관에는 기질 DNA 분자가 있어야 합니다. 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G), 시토신(C)의 질소 염기를 포함하는 네 가지 유형의 디옥시뉴클레오시드 삼인산(뉴클레오티드); 18~20개의 염기쌍으로 구성된 인공 합성 프라이밍 올리고뉴클레오티드(프라이머); 최적 온도가 68~72 ^° C인 내열성 효소인 DNA 중합효소, 그리고 마그네슘 이온.

PCR의 특이성은 DNA 단편의 선택에 따라 달라집니다. 이에 따라 인접 프라이머 올리고뉴클레오타이드가 합성됩니다. DNA 사슬의 혼성화 및 완성의 특이성은 아데닌-티민, 구아닌-시토신과 같은 질소 염기 쌍의 상보성 원리에 의해 결정됩니다.

결핵 복합체 결핵균의 유전체를 확인하기 위해 대부분의 검사 시스템에서 가장 효과적인 증폭 표적은 IS6110 DNA 단편입니다. 이 단편은 대부분의 결핵 결핵균 균주에서 유전체에 상당한 수(10~20)의 반복 서열을 가지고 있어 특이성과 함께 높은 분석 민감도를 보장합니다. 동시에, 반복 서열이 적거나 IS6110 단편이 없는 결핵 결핵균 균주도 보고되었습니다.

생물학적 샘플에서 DNA 분자 추출

PCR을 수행하려면 병원균의 DNA 분자를 최소한의 비특이적 DNA와 DNA 중합효소의 다양한 억제제와 함께 최소한의 부피로 생물학적 물질에서 분리해야 합니다.

시료 전처리는 분리된 DNA 분자에 의한 연구 대상 시료의 교차 오염을 방지하는 조건에서 수행해야 합니다. 이를 위해 실험실은 자외선으로, 테이블과 장비의 바닥, 작업대는 염소 함유 용액으로 예비 처리해야 합니다. 또한 깨끗한 장갑, 일회용 시험관, 자동 피펫 팁을 사용해야 합니다.

백혈구, 세포 파편 또는 염분이 많지 않은 임상 검체(뇌척수액, 기관지 세척액)에서 결핵균의 DNA를 분리하려면 분당 3~4천 회전으로 검체를 원심분리한 후, 침전물에 2% 트리톤 X-100 용액 20~30 µl를 첨가하고 90℃에서 30분간 가열하면 ^됩니다.

객담 검체 전처리에는 효율적인 액화가 필요하며, 일반적으로 4% 수산화나트륨과 N-아세틸-L-시스테인(NALC)을 검체 점도에 따라 검체당 50~80mg씩 사용합니다. NALC 용액은 즉석에서 준비하거나, NALC 분말을 검체에 직접 건조하여 첨가할 수 있습니다. 액화 후, 검체는 50ml 스크류 캡 튜브에 넣고 3,500~4,000rpm(3,000g)으로 15분간 원심분리합니다. 이는 배양 전 객담 전처리에 권장되는 조건과 동일합니다.

침전물에서 DNA를 추출하기 위해, 5~6몰 농도의 구아니딘 이소티오시아네이트 용액을 용해 시약으로 사용하고, DNA 분자를 흡착하는 미세다공성 산화규소 입자("규조토")를 사용하는 방법이 가장 많이 사용됩니다. 저해제와 같은 비특이적 물질을 2.5몰 농도의 구아니딘 이소티오시아네이트 용액과 에탄올 용액으로 세척한 후, DNA 분자를 물에 탈착시키고, 이 시료를 이용하여 PCR을 수행합니다. DNA 추출 기술을 단순화하기 위해 "규조토" 대신 산화규소로 코팅된 자성 미립자를 사용하는 경우가 많습니다. 이 경우, 원심분리 대신 미세관용 특수 자성 스탠드를 사용하여 입자를 침전시킵니다.

러시아에서 결핵균을 면역자기적으로 분리하고 병원균 DNA를 추출하는 독창적인 방법이 개발되었습니다. 결핵균의 면역자기적 분리를 위해, 산화규소로 코팅된 3~5μm 크기의 페로입자를 사용하며, 여기에 결핵균에 대한 다클론(토끼) 항체가 화학 결합으로 부착됩니다. 알칼리성 용해 후 객담 검체를 산성 Tris-HCl 용액으로 중화하고 면역자기 흡착제와 함께 배양합니다. 그런 다음, 교체 가능한 팁이 있는 자성 막대를 사용하여 면역페로입자를 수집하고 마이크로튜브로 옮겨 침전시킵니다. 2% Triton X-100 용액 20~30μl를 첨가하고 90 ^° C에서 30분간 가열합니다. 상층액은 PCR 분석을 위한 DNA 매트릭스로 사용됩니다.

생검 검체에서 결핵균 DNA를 추출하는 것은 어려운 문제입니다. 생검 용해를 위해 단백질 분해 효소 K를 최종 농도 200~500 mg/L로 56 ^° C에서 하룻밤 동안 처리합니다. 그런 다음, 알려진 방법 중 하나를 사용하여 추출합니다. 생검 검체의 PCR 분석에서 비특이적 DNA가 과도하게 검출되면 반응 억제가 발생하는 경우가 많아 DNA 추출을 반복해야 합니다.

결과 검출 방법

반응이 완료되면, 증폭된 병원체 DNA 조각은 다양한 방법을 사용하여 식별됩니다.

겔 전기영동법은 잘 알려져 있습니다. 이 경우, 얻어진 DNA 단편은 원하는 특정 DNA 단편을 포함하는 양성 대조군이나, 표준 분자 마커를 사용하여 측정한 단편의 크기(뉴클레오타이드 쌍의 수)를 이용하여 식별합니다.

이중 가닥 DNA에 포함된 특정 염료인 에티듐 브로마이드라는 물질이 존재하는 경우, 합성된 DNA 조각은 자외선의 영향으로 빛나는 띠로 드러납니다.

시작점으로부터 이동한 거리를 기준으로 전기영동을 통해 결정되는 DNA 조각의 크기는 알려진 분자량 마커나 양성 대조군과 일치해야 합니다.

PCR 결과를 확인하는 다른 방법은 단일 가닥 PCR 산물을 보완적인 올리고뉴클레오타이드(바이오틴으로 표지된 DNA 프로브)와 하이브리다이제이션한 다음, 예를 들어 스트렙타비딘 알칼리성 인산가수분해효소 접합체를 바이오틴에 결합시키는 효소 반응을 사용하여 검출하는 것입니다.

이러한 유형의 검출 방식을 기반으로, 효소 반응이 일어난 후 샘플의 광학 밀도를 읽어 PCR 결과를 자동으로 검출하는 PCR 분석기가 개발되었습니다.

이러한 방법의 단점은 비교적 짧은 DNA 분자 조각으로 인한 실험실 내 오염 가능성이 있다는 것입니다. 이러한 분자가 새로 검사한 샘플에 유입되면 PCR의 매트릭스가 되어 위양성 결과를 초래할 수 있습니다.

이와 관련하여, 위양성 결과를 방지하기 위해 실험실의 분리 및 격리에 대한 엄격한 규칙이 도입되었습니다. 생물학적 샘플에서 DNA를 추출하는 공간과 청정 구역에서 결과(전기영동)를 검출하는 공간입니다. 이러한 공간은 오염 가능성이 있는 구역입니다. 또 다른 격리 구역은 연구 대상 DNA 샘플을 PCR 반응 혼합물과 함께 시험관에 넣는 청정실입니다. 마지막으로, 주요 장치인 DNA 증폭기는 별도의 사무실로 옮겨야 합니다.

이전 반응의 산물인 앰플리콘에 의한 오염을 방지하기 위해 일부 PCR 검사 시스템은 체외 사슬 합성 과정에서 해당 위치에 생성되는 디옥시뉴클레오시드 티미딘 대신 디옥시뉴클레오시드 유리딘을 함유합니다. 즉, 천연 DNA에 존재하는 질소 염기인 티민이 우라실로 대체됩니다. 분석 대상 물질의 반응 혼합물에 우라실 DNA 글리코실라제를 첨가하면 디옥시우리딘으로 오염된 단편만 파괴되고, 디옥시티미딘을 함유한 천연 분석 DNA는 파괴되지 않습니다. 이후 94 ^° C에서 가열하면 이 효소가 불활성화되어 PCR 증폭에 영향을 미치지 않습니다.

RRNA 등온 증폭을 기반으로 하는 검사 시스템이 있는데, 이 시스템에서는 역전사 및 DNA 분자 합성이 먼저 수행되며, 이는 이후 RNA 분자 합성의 매트릭스가 됩니다. RNA 증폭물은 반응 튜브 용액에서 혼성화하는 동안 아크리딘 염색 DNA 프로브를 사용하여 검출됩니다. 이 방법은 높은 민감도 외에도 하나의 튜브에서 분석을 수행하여 오염을 방지할 수 있다는 장점이 있습니다. 저자들에 따르면, 호흡기 검체에서 이 방법의 민감도는 90%에 달하며 특이도는 99~100%입니다.

실시간 PCR에 새로운 검출 방법이 도입되었습니다. 이러한 방법의 주요 차이점은 PCR과 그 결과의 검출이 하나의 밀폐된 시험관에서 동시에 수행된다는 것입니다. 이는 기술적으로 분석 방법을 단순화할 뿐만 아니라, 이전 PCR 생성물에 의한 실험실 및 검체의 오염을 방지합니다.

실시간 PCR에서 결과는 PCR 중 증폭된 특정 DNA 단편과 형광 DNA 프로브의 혼성화로 발생하는 형광을 통해 검출됩니다. 형광 DNA 프로브의 구조는 효소 반응의 결과로 형광 마커가 방출되거나 PCR 중 증폭된 원하는 DNA 분자와 특이적으로 혼성화될 때만 형광 소광제 분자로부터 거리를 두도록 구성됩니다. 프로브와 혼성화된 분자의 수가 증가함에 따라 검출 가능한 수준으로 형광이 증가하는 정도는 증폭된 생성물의 분자 수에 비례합니다. 매 PCR 사이클 동안 DNA 단편 분자의 수가 두 배로 증가하므로, 형광이 검출되고 증가하는 사이클 횟수는 원래 샘플의 DNA 분자 수에 반비례합니다. 결핵균 DNA 단편의 분자를 여러 개의 서로 다른 농도로 측정하여 반응에 교정 물질로 도입하면, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 연구 대상 물질의 DNA 게놈 수를 계산할 수 있습니다.

각 표준 샘플은 복제됩니다. 정량적 기준은 검출 가능한 형광의 시작과 성장에 필요한 최소 PCR 사이클 수입니다. 가로축은 사이클 수이고 세로축은 형광 값입니다. DNA 농도는 형광이 나타나는 데 필요한 사이클 수에 반비례합니다. 오른쪽 열의 창(21-32)은 해당 농도에 대한 사이클 수를 보여줍니다. DNA 단편 10배 농도 10 ² -10 ⁶ ml의 차이는 3.2-3.4 사이클입니다. 두 환자의 경우 IS6110 단편의 농도는 약 10 ³ /ml 및 10 ⁴ /ml였습니다. 결핵균 게놈에서 분석된 단편의 반복 횟수(6-20)를 고려할 때 임상 샘플의 결핵균 수는 각각 약 100개와 1000개 세포입니다.

결핵 진단에 PCR의 적용

PCR 방법은 결핵의 신속한 진단에 가장 널리 사용됩니다. 임상 검체(가래, 기관지 세척액, 흉막 삼출액, 소변, 뇌척수액, 골용해 천자, 여성 생식기 흡인물 및 다양한 생검)에서 결핵균을 검출할 수 있습니다. 네덜란드에서 폐결핵 확진 환자 340명의 가래 및 기관지 세척액 약 500개를 대상으로 실시한 연구에서 PCR, 배양, 도말 현미경 검사법의 민감도를 비교 분석했습니다. 분석 민감도는 각각 92.6%, 88.9%, 52.4%였습니다. 모든 방법의 특이도는 약 99%였습니다.

도말 현미경, 로웬스타인-젠슨 배지, VASTES 검사 시스템, 그리고 PCR 분석을 이용한 결핵균 검출 효율을 비교하였다. PCR은 74.4%, 현미경은 33.8%, 고체 배지는 48.9%, 그리고 VASTES는 55.8%의 민감도를 보였다. 로웬스타인-젠슨 배지에서 도말 현미경으로 검출한 평균 시간은 24일이었다. VASTES는 13일, PCR은 1일이었다.

또한, 결핵 치료의 효과를 모니터링하는 민감하고 빠른 방법으로 PCR을 사용할 수 있는 가능성에 대해서도 논의합니다.

효과적인 화학요법과 함께 PCR 방법을 통해 결핵균 DNA를 검출하는 데는 더 오랜 시간이 걸립니다. 형광 현미경으로 검출한 세균 배설물과 비교했을 때 평균 1.7개월, 세균학적 검사와 비교했을 때 2.5개월이 걸립니다.

폐외 결핵의 진단

PCR은 민감한 방법으로서 중요성이 특히 크며, 폐외 형태의 경우 임상적, 방사선적 방법과 진단 물질에서 결핵균을 판별하는 전통적인 세균학적 방법이 효과적이지 않기 때문입니다.

소변 샘플을 검사한 결과, 활동성 요로결핵 환자 17명 중 16명에서 PCR 분석 결과가 양성이었고, 비활동성 신장결핵 환자 4명과 비결핵성 요로질환 환자 39명에서 음성으로 나타났습니다.

원인 미상의 발열과 결핵성 질환 의심 환자의 골수 흡인물 연구에서 PCR 분석의 효율성이 입증되었습니다. 소아의 결핵성 림프절염 진단을 위해 결핵성 림프절염 의심 소아 67명의 천자 흡인물 102개와 생검 검체를 연구했습니다. 양성 결과가 나왔습니다. 실시간 PCR - 71.6%, 형광 현미경 - 46.3%, 배양 검사 - 41.8%. 고양이 할큄병 환자에서 50건의 림프절 생검을 연구한 결과, 모든 결과가 음성이었습니다. 따라서 PCR 분석의 특이도는 100%였습니다. 같은 연구에서 림프절 천자 생검에서 M. avium을 검출할 가능성이 제시되었습니다.

불임 환자에서 여성 생식기 결핵 진단은 가장 어려운 진단 문제 중 하나로 알려져 있습니다. 결핵이 의심되어 복강경 검사를 받은 25명의 환자 중 14명(56%)에서 자궁내막 생검, 자궁내막 흡인물, 더글라스 주머니 액체 검체의 PCR 검사에서 양성 결과가 나왔습니다. 도말 현미경 검사와 배양 검사에서 각각 1명과 2명이 양성 결과를 보였습니다. 이 사례들도 PCR 양성이었습니다. 대부분의 PCR 양성 결과는 조직학적 검사에서 결핵의 특징적인 소견을 보인 경우였고, 복강경 검사에서 결핵이 의심되는 사례에서는 소수만이 양성 결과를 보였습니다. 결핵에 대한 복강경 검사 자료가 없는 경우 단 한 건의 PCR 양성 결과만 나왔습니다.

폐외 결핵을 진단할 때, 임상의들은 PCR 방법을 이용하여 혈액 검체를 검사하여 병원균을 식별할 수 있을지에 대한 의문을 갖는 경우가 많습니다. 문헌 자료에 따르면, 진행된 HIV 감염에서도 혈액 검체에서 결핵균 DNA를 검출할 수 있습니다. 결핵균 DNA는 신장 이식과 면역억제 치료를 받는 환자의 다양한 장기에 발생한 전신 결핵에서만 검출되었습니다.

[ 59 ], [ 60 ], [ 61 ], [ 62 ], [ 63 ]

결핵균의 종 식별

PCR 방법은 결핵 복합체의 항산균과 일부 유형의 비결핵성 항산균을 1차 배양 후 신속하게 식별하는 데 매우 효과적일 수 있습니다. 이 경우 PCR을 사용하면 양성 결과의 후속 배양 식별에 필요한 7~10일을 절약할 수 있습니다. PCR 연구는 높은 민감도를 달성하기 위해 임상 물질의 복잡한 검체 준비가 필요하지 않으므로 기술적으로 매우 간단합니다. 이러한 검사 시스템(Organon의 MB BacT.)에서 80개의 양성 배양을 검사할 때 모든 양성 PCR 분석 결과는 엄격하게 특이적이었고 1일 이내에 수행되었습니다. 배양에서 얻은 다른 유형의 항산균을 식별하기 위해 병원체 DNA를 아크리딘으로 표지된 특정 DNA 프로브와 혼성화하고, 화학 발광계를 사용하여 화학 발광이 나타나거나 혼성화 후 시각적으로 평가하여 균주를 검출합니다. 이 키트는 제한된 수의 종, 즉 결핵균 복합체, M. avium, M. avium 복합체, M. kansasii, M. gordonae만을 식별합니다.

A. Telenti 등은 PCR과 두 가지 제한 효소(특정 지점에서 DNA 분자를 절단할 수 있는 효소)를 이용한 후속 처리를 기반으로 임상적으로 중요한 결핵균의 종을 식별하는 비교적 간단하고 저렴한 방법을 개발했습니다. 이 경우, 열충격 단백질(65 kDa)을 암호화하는 DNA 단편을 증폭한 후, PCR에서 얻은 439 뉴클레오티드 쌍의 DNA 단편을 Bste II와 Нае III라는 두 가지 효소로 각각 처리합니다. 그런 다음, 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 얻은 두 생성물을 분석하고, 100~1000 뉴클레오티드 쌍 길이의 표준 DNA 단편(분자 DNA 마커) 세트를 사용하여 크기(뉴클레오티드 쌍 수)를 결정합니다. 정의된 각 종(결핵균, 조균, 인트라셀룰라레, 칸사시균, 포르투이툼)에서 각 제한 효소마다 크기가 다른 DNA 단편이 2개 또는 3개 발견되었습니다. 이렇게 생성된 서로 다른 크기의 DNA 조각을 결합하면 이들 종을 서로 구별할 수 있습니다.

단일 연구에서 100종 이상의 항산균을 식별하는 데 도움이 되는 생물학적 DNA 마이크로어레이 기술이 개발되고 있습니다.

16S rRNA의 가변 영역을 PCR로 증폭한 다음, 앰플리콘을 해당 1차 구조와 비교하여 시퀀싱하는 방법으로 종을 식별할 수도 있는데, 이를 통해 40종 이상의 결핵균 종을 식별할 수 있습니다.

PCR은 결핵균 복합체 내 종을 식별하는 데에도 사용될 수 있으며, 여기에는 우형 결핵균과 우형 결핵균 BCG의 감별도 포함됩니다. 이는 유전체 영역 RD1, RD9, RD10에서 특정 유전자의 존재 여부를 분석함으로써 이루어집니다. RD1은 우형 결핵균 BCG에는 존재하지 않지만, 우형 결핵균을 포함한 병원성 결핵균에는 존재합니다.

PCR을 이용한 결핵균의 약물 감수성 결정

결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 약물 감수성 또는 내성을 결정하는 분자유전학적 방법의 과제는 알려진 유전자의 특정 뉴클레오타이드 서열에서 돌연변이를 식별하는 것으로 축소됩니다. 주요 방법은 증폭 후 이러한 서열을 직접 판독(시퀀싱)하거나, PCR 과정에서 증폭된 비오틴 표지 DNA 단편을 DNA 프로브와 혼성화하는 것입니다. 두 방법 모두 DNA 프로브를 사용할 때 효소 접합체(스트렙타비딘-알칼리 포스파타제)를 사용하여 니트로셀룰로오스 막에서 혼성화가 이루어지지 않거나 불완전하게 이루어지는 뉴클레오타이드 서열의 치환을 식별하는 것을 포함합니다. LIPA-Rif-TB 방법은 LIPA-Rif-TB 방법입니다.

약물 감수성 또는 내성을 담당하는 PCR 증폭 유전자 영역의 알려진 돌연변이와 상보적인 미세 영역에서 국소적으로 고정된 DNA 프로브의 형광을 측정하는 방법을 마이크로바이오칩 방법이라고 합니다. 이 연구를 수행하는 기본 알고리즘은 다음과 같습니다. 임상 검체 또는 항산균 배양액에서 DNA를 분리한 후, 리팜피신에 대한 약물 감수성을 담당하는 groB 유전자 또는 이소니아지드에 대한 감수성을 담당하는 항산균 단백질을 암호화하는 katG 및 inhA 유전자의 해당 단편을 증폭하기 위해 PCR을 수행해야 합니다. PCR 결과는 아가로스 겔 전기영동을 통해 평가되며, 이는 원하는 길이의 해당 DNA 단편이 수신되었음을 확인합니다. 그런 다음, 형광 표지를 DNA에 도입하기 위해 두 번째 PCR을 수행합니다. PCR 결과는 다시 겔 전기영동으로 확인합니다. 이후, 하이브리다이제이션(하룻밤 배양)을 실시하고, 얻어진 물질을 바이오칩에서 세척합니다. 바이오칩은 작은 유리판에 고정된 다수의 짧은 DNA 사슬(프로브)로, 약물 감수성 결핵균의 돌연변이 발생 지점에 있는 뉴클레오타이드 서열과 상보적이며, 약물 내성을 유발하는 돌연변이 서열과도 상보적입니다. 플레이트에서 DNA 프로브의 위치는 엄격하게 정의되며, 하이브리다이제이션 중 관찰되는 형광 수준은 특수 판독 장치를 사용하여 결과를 결정하기 위해 사용됩니다. 이와 관련하여, 분석 결과는 특수 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정됩니다.

최근 몇 년 동안, 실시간 PCR 기술을 기반으로 결핵균의 약물 감수성을 확인하는 대체 방법이 개발되어 이러한 연구를 폐쇄된 시험관 모드에서 수행할 수 있게 되었습니다.

그림 13-13은 실시간 PCR을 사용하여 리팜피신에 대한 약물 내성을 결정하는 결핵균의 임상 배양 분석 결과를 보여줍니다.218 - 대조 샘플(리팜피신에 민감함);93 - Ser-Trp TCG-TGG 돌연변이에 대한 양성 대조군;4482 - Ser-Leu TCG-TTG 돌연변이에 대한 양성 대조군;162-322 - 실험 샘플.4개 채널에 대한 증폭의 속도론적 곡선을 계산한 결과: 채널 1: 393 - Ser-Trp TCG-TGG 돌연변이에 대한 양성 대조군;채널 2: 4482 - Ser-Leu TCG-TTG 돌연변이에 대한 양성 대조군;162, 163, 172, 295 - 실험 샘플;채널 4: 실험에 참여한 모든 샘플의 증폭의 속도론적 곡선.증폭 반응의 양성 대조군. 결론: 분석 결과 리팜피신 내성을 결정하는 다음과 같은 돌연변이가 확인되었습니다. 샘플 162, 163, 172, 295에서 Ser-Leu TCG-TTG. 이소니아지드 내성을 결정하는 데에도 동일한 원리가 사용되었는데, 이소니아지드 내성을 결정하는 가장 빈번한 돌연변이는 katG와 inhA 유전자입니다.

[ 64 ], [ 65 ], [ 66 ], [ 67 ], [ 68 ], [ 69 ]

결핵균의 균주 식별

결핵균 균주 동정에 가장 많이 연구된 방법은 제한효소 단편 길이 다형성(RFLP) 기술로, Pvu II 효소를 이용하여 결핵균 DNA를 단편화(제한)하고, 얻어진 단편을 IS6110 반복 서열의 DNA에 존재하는 특정 서열과 교잡시키는 것을 기반으로 합니다. IS6110 반복 서열의 수와 DNA 상 위치의 차이, 그리고 제한효소의 특정 공격 지점(제한 부위)과 IS6110 요소 사이의 거리의 차이로 인해 종내 변이가 발생합니다. 이 기술은 매우 복잡하고 노동 집약적입니다. 결핵균 배양액에서 분리한 DNA를 제한효소로 처리한 후, 겔 전기영동을 수행하고, 다양한 길이의 DNA 단편을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겨 IS6110 요소 단편과 교잡시킨 후, 효소 반응을 통해 결과를 검출합니다. 그 결과 생성된 특정 밴드 패턴은 특정 결핵균주의 DNA를 특징짓습니다. 컴퓨터 분석을 통해 균주의 동일성 또는 연관성을 확인할 수 있습니다. RFLP 방법이 가장 판별력이 뛰어나 분석된 균주에서 가장 많은 차이를 나타내지만, 일부 균주에서 관찰된 IS6110 반복 횟수가 적기 때문에(5회 미만) 효과적이지 않습니다. 그림 13-14는 균주의 RFLP 타이핑 결과를 보여줍니다.

대안으로 스폴리고타이핑(spoligotyping) 방법이 있습니다. 스폴리고타이핑은 DR 영역의 직접 반복 서열 사이의 중간 단계에 있는 스페이서 DNA 서열의 다형성을 분석하는 방법입니다. 균주의 스폴리고타이핑을 수행할 때, DR 영역을 한정하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 다양한 길이의 단편을 형성하여 가변적인 중간 DNA 영역과 교잡합니다. 연구자들에 따르면, DR 영역의 스페이서 서열 분석은 균주의 1차 스크리닝 및 예비 역학 분석뿐 아니라 임상 자료를 직접 연구하는 데에도 더 간단하고 생산적이며 적합한 것으로 보입니다.

분명히 더 효과적이고 기술적으로 접근 가능한 방법은 VNTR(영어 단어의 약자) 또는 결핵균 DNA의 정확한 탠덤 반복 서열의 가변적인 수를 측정하는 방법입니다. 이 방법은 PCR만을 사용하며 추가적인 조작이 필요하지 않습니다. 균주와 유전자좌에 따라 탠덤 반복 서열의 수가 다르기 때문에, 다양한 크기의 단편을 확인하고 PCR 산물의 전기영동 결과에서 분석합니다. 연구진에 따르면, VNTR을 사용하면 RFLP 방법보다 균주를 더 정확하게 구별할 수 있습니다.

최근 몇 년 동안, 약물에 대한 내성이 강한 W-베이징 계열의 결핵균(때로는 베이징 균주라고도 함)의 확산에 많은 관심이 집중되었습니다.

분자생물학 연구의 질에 대한 기본 요건

[ 70 ], [ 71 ], [ 72 ], [ 73 ]

PCR 수행을 위한 주요 규제 문서

러시아 연방 보건부 명령: 2000년 2월 7일 제45호; 2003년 3월 21일 제109호; 2000년 2월 21일 제64호. 지침: 1.3.1888-04 "병원성 III-IV군 병원성 생물학적 물질에 감염된 물질의 PCR 연구 중 작업 구성"; 1.3.1794-03 "병원성 I-II군 미생물에 감염된 물질의 PCR 연구 중 작업 구성". 2003; 3.5.5.1034-01 "PCR 방법을 이용한 작업 시 병원성 I-IV군 세균에 감염된 시험 물질의 소독", 2001. 결핵 검출, 진단 및 치료를 위한 통합 미생물학 연구 방법에 관한 지침 부록 11.

[ 74 ], [ 75 ], [ 76 ]

직원

분자생물학 연구는 임상 검사실 진단 의사, 세균학자, 바이러스학자, 임상 진단 검사실 생물학자뿐만 아니라, 확립된 방식으로 전문화와 고급 훈련을 거친 2차 의학 교육을 받은 전문가가 수행할 수 있습니다.

실험실 건물 배치

다음과 같은 실험실 시설이 필요합니다.

• 샘플 처리 구역 - 방법론적 지침 13.1888-04에 따라 병원성 그룹 III-IV의 감염원을 다루도록 개조된 실험실입니다.
• PCR 반응 혼합물을 준비하는 구역은 실험실 내부 오염으로부터 보호되는 실험실, 즉 "청결" 구역입니다.
• • PCR 산물을 분석하기 위해 전기영동 또는 혼성화를 사용하는 경우, 증폭된 DNA 단편이 증폭 튜브에서 추출되어 외부 환경으로 반입될 수 있는 실험실은 PCR 실험실 요건(방법론 지침 1.3.1794-03, 방법론 지침 1.3.1888-04)에 따라 이전 문단에 명시된 실험실과 완전히 격리되어야 합니다. 전기영동 구역에서 시료 처리 구역 및 "청결" 구역으로의 모든 인력, 장비, 자재 및 물건의 이동, 그리고 환기 시스템을 통한 공기 이동이나 외풍으로 인한 공기 이동은 배제되어야 합니다. 이 구역은 PCR 산물의 형광 검출에는 필요하지 않습니다.
• 결과 문서화 및 처리실에는 컴퓨터와 필요한 사무 장비가 갖춰져 있습니다. 이 실에는 튜브를 열지 않고도 PCR 산물을 검출할 수 있는 장비가 있을 수 있습니다. - 실시간 PCR을 위한 형광 PCR 검출기 및 열 순환기.

객담의 1차 처리에 대한 위생 및 역학적 요건은 결핵균을 다루는 데 필요한 표준 미생물학적 요건과 유사합니다.

[ 77 ], [ 78 ], [ 79 ], [ 80 ]

PCR 진단을 위한 실험실 장비 전체 세트

실험실 키트에는 다음 방에 필요한 장비가 포함되어 있습니다.

• 샘플 준비실에는 다음 장비가 있습니다. 보호 등급 II의 층류 후드 "SP-1.2": 에펜도르프 시험관을 위한 가열 뚜껑이 있는 고체 상태 온도 조절 장치; 13,000 rpm의 미세 원심 분리기; 원심 분리기("Vortex"); -20 ^° C ~ +10 ^° C의 온도 범위를 갖는 냉장고; "Proline" 시리즈의 가변 용량 피펫; 트랩 플라스크 OM-1이 있는 펌프; 피펫 랙; 작업 스테이션 랙 200x0.5 ml; 작업 스테이션 랙 50x1.5 ml; 시험관 보관 랙 80x1.5 ml;
• 반응 혼합물 제조실: 보호 챔버 PCR 박스("Laminar-C. 110cm); 원심분리기 "Vortex"; "Proline" 시리즈의 가변 용량 피펫; 피펫 랙; 워크스테이션 랙 200x0.2ml; 시험관 보관 랙 80x1.5ml; 온도 범위가 -20 ^° C ~ +10 ^° C인 냉장고;
• 전기영동실: 수평 전기영동실; 전원; 투과조명기;
• 컴퓨터와 소프트웨어가 포함된 DNA 증폭기 또는 핵산 분석기(실시간 PCR)는 사용 가능한 어느 방에나 설치 가능합니다. 실시간 PCR 기술을 사용하는 경우 전기영동실은 필요하지 않습니다.

[ 81 ], [ 82 ], [ 83 ], [ 84 ]

외부 품질 관리

실험실은 객관적으로 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 실험실 연구의 질을 평가하는 외부 시스템에 참여해야 합니다.

품질 관리 시스템 참여자는 다음을 받습니다: 박테리아 세포의 동결건조 현탁액이 담긴 앰플 12개(그중 2개는 대장균 함유), 결핵성 항산균(독성 균주)이 담긴 앰플 3개(농도 10 ² /ml), 유사한 균주의 세포가 담긴 앰플 3개(농도 10 ⁴ /ml), 비결핵성 항산균인 M. avium-intracellulare와 M. kansasii가 담긴 앰플 2개(농도 10 ⁵ /ml).

외부 품질 평가를 위해 발송된 테스트는 이 분야에서 광범위한 경험을 보유한 두 개의 독립적인 실험실에서 사전 테스트를 거칩니다.

[ 85 ], [ 86 ]