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항문열상은 진단이 어렵지 않습니다. 병력과 특징적인 호소가 항문열상이 있음을 시사합니다. 항문 진찰을 통해 진단이 명확해집니다. 엉덩이를 벌리면 항문 바깥쪽 가장자리에 열상 또는 보초결절이 관찰됩니다. 진찰 중 항문열상이 보이지 않으면 직장을 정밀하게 검사해야 합니다. 이 경우, 항문관의 환부 벽에 봉합선이 있는지 확인합니다. 심한 통증 증후군과 괄약근 경련으로 인해 급성기에는 직장 S상결장경 검사를 시행해서는 안 됩니다. 항문열상과 다른 질환을 감별해야 하는 경우, 열상 부위에 1% 노보카인 용액 4~5ml를 미리 주입한 후 검사를 시행할 수 있습니다.
항문열상의 감별진단은 미골통증, 항문형 크론병, 비특이성 궤양성 대장염 등과 함께 시행됩니다.