유전성 질환 진단을 위한 분자유전학적 방법

DNA 기술은 특정 염색체에서 특정 유전병의 기원을 담당하는 돌연변이 유전자의 위치를 파악하는 데 사용됩니다. 유전자는 DNA의 한 부분이고, 유전자 돌연변이는 DNA의 1차 구조 손상을 의미하므로(돌연변이는 DNA 서열의 모든 변화로 정의되며, 위치와 개체의 생존 가능성에 미치는 영향은 무관함), 유전 질환 환자의 중기 염색체를 조사하여 병리학적 유전자의 위치를 파악할 수 있습니다. 분자유전학 방법은 DNA 구조 변화 수준에서 질병을 진단할 수 있는 기회를 제공하며, 유전 질환의 위치를 파악할 수 있도록 합니다. 분자유전학 방법은 단 하나의 염기 치환과 관련된 돌연변이도 식별할 수 있습니다.

유전자 동정에서 가장 중요한 단계는 분리입니다. DNA는 핵을 포함하는 모든 종류의 조직과 세포에서 분리할 수 있습니다. DNA 분리 단계는 다음과 같습니다. 세포의 급속 용해, 원심분리를 통한 세포 소기관 및 세포막 조각 제거, 페놀과 클로로포름을 이용한 단백질 효소 분해 및 용액에서 추출, 에탄올 침전을 통한 DNA 분자 농축.

유전학 실험실에서는 혈액 백혈구에서 DNA를 분리하는 경우가 가장 흔하며, 이를 위해 환자의 정맥혈 5~20ml를 항응고제(헤파린) 용액이 담긴 멸균 시험관에 담습니다. 그런 다음 백혈구를 분리하고 위의 단계에 따라 처리합니다.

연구용 재료 준비의 다음 단계는 엄격하게 특정 염기 서열을 가진 부위에서 DNA를 단편으로 "절단"하는 것인데, 이는 박테리아 효소인 제한 효소(제한 효소)를 사용하여 수행됩니다. 제한 효소는 이중 가닥 DNA 분자에서 4~6개, 드물게는 8~12개 뉴클레오티드의 특정 서열을 인식하고, 제한 부위라고 불리는 이러한 서열의 위치에서 DNA를 단편으로 나눕니다. 결과적으로 생성되는 DNA 제한 단편의 수는 제한 부위의 발생 빈도에 따라 결정되며, 단편의 크기는 원래 DNA 분자의 길이를 따라 이러한 부위가 분포하는 방식에 따라 결정됩니다. 제한 부위가 더 자주 위치할수록 제한 효소 후 DNA 단편의 길이는 짧아집니다. 현재 500종 이상의 박테리아 유래 제한 효소가 알려져 있으며, 각 효소는 고유한 특정 뉴클레오티드 서열을 인식합니다. 앞으로 제한 부위는 DNA의 유전적 마커로 사용될 수 있습니다. 제한효소에 의해 생성된 DNA 단편은 아가로스 또는 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동을 통해 길이별로 정렬할 수 있으며, 이를 통해 분자량을 측정할 수 있습니다. 일반적으로 겔 내의 DNA는 특정 염색(보통 에티듐 브로마이드)을 하고 투과된 자외선으로 겔을 관찰하여 식별합니다. DNA 위치 확인 부위는 빨간색으로 표시됩니다. 그러나 사람의 경우, DNA가 여러 제한효소에 의해 처리될 때 길이가 다른 단편이 너무 많이 형성되어 전기영동으로 분리할 수 없습니다. 즉, 전기영동에서 개별 DNA 단편을 시각적으로 식별할 수 없습니다(겔 전체 길이에 걸쳐 균일한 염색이 나타남). 따라서 이러한 겔에서 원하는 DNA 단편을 식별하기 위해 표지된 DNA 프로브를 이용한 혼성화 방법이 사용됩니다.

DNA 또는 RNA의 단일 가닥 부분은 구아닌이 항상 시토신에, 아데닌이 티민에 결합하는 상보적 가닥과 결합(혼성화)할 수 있습니다. 이것이 이중 가닥 분자가 형성되는 방식입니다. 복제된 유전자의 단일 가닥 사본을 방사성 표지로 표지하면 프로브를 얻습니다. 프로브는 상보적 DNA 부분을 찾을 수 있으며, 이는 자가방사선촬영법을 사용하여 쉽게 식별할 수 있습니다. 늘어난 염색체에 방사성 프로브를 첨가하면 유전자가 특정 염색체에 위치하는 것을 확인할 수 있습니다. DNA 프로브를 사용하면 서던 블롯 분석에서 특정 영역을 확인할 수 있습니다. 검사 대상 DNA 부분에 정상 유전자가 포함되어 있으면 혼성화가 발생합니다. 비정상적인 뉴클레오티드 서열이 존재하는 경우, 즉 해당 염색체 구조에 돌연변이 유전자가 포함된 경우 혼성화가 발생하지 않아 병적인 유전자의 위치를 확인할 수 있습니다.

DNA 프로브를 얻기 위해 유전자 클로닝 방법을 사용합니다. 이 방법의 핵심은 유전자 또는 유전자의 특정 부분에 해당하는 DNA 단편을 클로닝 입자, 일반적으로 박테리아 플라스미드(박테리아 세포에 존재하는 고리 모양의 염색체 외 DNA로 항생제 내성 유전자를 함유함)에 삽입한 후, 삽입된 인간 유전자가 포함된 플라스미드를 가진 박테리아를 증식시키는 것입니다. 플라스미드에서의 합성 과정 덕분에 인간 유전자 또는 유전자의 특정 부분을 수십억 개 복제할 수 있습니다.

방사성 표지나 형광염색체로 표시된 DNA 사본은 연구 대상 DNA 분자 풀에서 상호 보완적인 서열을 검색하기 위한 프로브로 사용됩니다.

현재, DNA 프로브를 이용해 유전자 돌연변이를 진단하는 다양한 방법이 있습니다.

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