골관절염의 실험 모델

연골은 한 종류의 세포(연골세포)만 포함하는 고도로 특수화된 조직으로, 혈관과 림프관이 없는 것이 특징입니다. 연골은 주로 활액으로부터 흡수되어 영양을 얻습니다. 연골세포 대사는 연골세포와 주변 조직에서 국소적으로 생성되는 여러 용해성 인자에 의해 조절됩니다. 연골세포의 기능은 세포외 환경의 구성(산소 장력, 이온 농도, pH 등), 세포외 기질의 구성, 세포와 기질의 상호작용, 그리고 물리적 신호에 따라 달라집니다. 실험 모델링의 주요 목표는 성숙 세포의 표현형을 변화시키지 않고 세포외 환경에서 배양하는 것입니다. 두 번째 목표는 연골세포의 화학적 및/또는 물리적 신호에 대한 조기, 지연, 단기 또는 장기 반응을 연구하기 위한 배양을 만드는 것입니다. 또한, 시험관 내 연구는 골관절염에서 연골세포의 행동을 연구할 기회를 제공합니다. 세 번째 목표는 관절 내 다양한 조직의 상호작용을 연구할 수 있는 공동 배양 시스템을 개발하는 것입니다. 네 번째 과제는 후속 이식을 위한 연골 임플란트를 준비하는 것입니다. 마지막으로 다섯 번째 과제는 연골 재생을 촉진하고/하거나 연골 흡수를 억제할 수 있는 성장 인자, 사이토카인 또는 치료제를 연구하는 것입니다.

지난 수십 년 동안 단층 배양, 현탁 배양, 연골 배양, 이식편, 공배양, 불멸 세포 배양 등 다양한 관절 연골 세포 배양 모델이 개발되었습니다. 각 배양은 고유한 장단점을 가지고 있으며, 연골세포 대사의 특정 측면을 연구하는 데 적합합니다. 따라서 연골 이식편은 세포 표면 수용체와 정상적인 세포-기질 및 세포-기질 상호작용을 필요로 하는 기질 요소의 회전율을 연구하는 데 탁월한 모델입니다. 동시에, 분리된 세포 배양에서 기질 침전물이나 연골세포 대사 조절 기전을 연구하는 것이 권장됩니다. 저밀도 단층 배양은 세포 분화 과정을 연구하는 데 필수적입니다. 천연 또는 합성 기질에 현탁된 배양은 기계적 스트레스에 대한 연골세포의 적응 반응을 분석하는 모델입니다.

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연골세포 배양

체외 연구를 위해 연골 조직을 선택할 때 몇 가지 중요한 사항을 고려해야 합니다. 연골세포의 기질 구성과 대사 활동은 관절마다 다르며, 연골세포의 대사 활동은 조직 내 연골세포 위치의 깊이에 따라 달라집니다. 이러한 데이터는 다양한 깊이의 연골 영역에서 분리된 연골세포 아군을 연구하는 여러 실험을 통해 얻어졌습니다. 관절 연골의 표층과 심층에 위치한 배양 연골세포 간에는 여러 형태학적 및 생화학적 차이가 발견되었습니다. 표층 세포는 프로테오글리칸이 부족한 희소한 섬유성 기질을 합성하는 반면, 심층 세포는 섬유와 프로테오글리칸이 풍부한 기질을 생성합니다. 또한, 표층 세포는 심층 연골세포보다 상대적으로 더 많은 작은 비응집 프로테오글리칸과 히알루론산을 생성하고, 아그레칸과 케라탄 황산염을 상대적으로 적게 생성합니다. 다양한 깊이의 연골 영역에서 분리된 연골세포 대사의 또 다른 중요한 특징은 외인성 자극에 대한 반응입니다. M. Aydelotte 등에 따르면, 연골 표층 영역의 소 연골세포는 심층 영역의 세포보다 IL-1에 더 민감했습니다.

세포의 행동은 조직 위치에 따라 달라집니다. 같은 동물의 갈비뼈와 귀 연골에서 추출한 연골세포는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 TGF-β와 같은 성장 인자에 다르게 반응합니다. FGF는 배양된 갈비뼈에서 티미딘, 프롤린, 류신의 유입을 증가시켰지만, 귀 연골세포에서는 그렇지 않았습니다. TGF-β는 갈비뼈와 귀 연골에서 티미딘의 유입을 증가시켰지만, 귀 연골세포에서 티미딘과 프롤린의 유입에는 영향을 미치지 않았습니다. 연골에 가해지는 스트레스가 높은 부위의 연골 세포는 스트레스가 낮은 부위의 연골 세포와 다릅니다. 따라서 생체 내에서 가장 큰 부하를 받는 반월상 연골로 덮이지 않은 경골 관절면 중앙 부위에서 추출한 성숙한 양의 무릎 관절 연골 연골세포는 반월상 연골로 덮인 부위의 세포보다 아그레칸을 적게 합성하지만, 데코린을 더 많이 합성합니다. 저자들은 관절의 합성 기능을 연구할 때 동일한 관절 부위의 연골을 사용하는 것이 중요하다고 강조합니다.

연골세포의 대사와 조절 인자에 대한 반응은 또한 기증자의 나이, 골격 발달 및 세포를 채취한 관절의 상태에 크게 좌우됩니다.인간 연골세포에서 나이가 들면서 증식 반응이 현저히 감소하는 것이 관찰됩니다.40~50세와 60세 이상의 기증자에서 가장 큰 감소가 관찰됩니다.게다가 성장 인자(예: FGF 및 TGF-β)에 대한 증식 반응의 심각도는 노화와 함께 감소합니다.연골세포 증식의 양적 변화 외에도 질적 변화도 있습니다.젊은 기증자(10~20세)의 세포는 TGF-β보다 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)에 더 잘 반응하는 반면, 성인 기증자의 세포에서는 그 반대가 관찰됩니다.연골세포의 합성 기능과 성장 인자에 대한 반응의 연령 의존적 변화를 설명하는 데 여러 가지 메커니즘이 사용됩니다. 여기에는 표면 세포 수용체의 수와 친화도의 감소, 성장 인자와 사이토카인의 합성과 생물학적 활성의 변화, 수용체 이후 신호의 변형이 포함됩니다.

관절의 병리학적 상태는 연골세포의 형태와 대사 활성에도 영향을 미칩니다. 따라서 J. Kouri 등(1996)은 골관절염 환자의 연골에서 세 가지 연골세포 아형을 확인했습니다. 연골 중간 표층과 상부의 연골세포는 군집을 형성하고 더 많은 양의 프로테오글리칸과 콜라겐을 합성합니다. TGF-β와 인슐린 유사 성장 인자(IGF)는 연골세포의 프로테오글리칸 합성을 자극하고 IL-1과 TNF-α의 효과를 부분적으로 중화할 수 있습니다. 골관절염에 걸린 연골의 이식편과 골관절염 환자의 연골에서 분리한 연골세포는 건강한 연골의 연골세포보다 TGF-β의 자극에 더 민감합니다. 이러한 차이점은 관절 연골 상층 연골세포의 표현형 변화와 관련이 있을 가능성이 높습니다.

개별 연골세포의 분리는 ECM(외피세포층)에 단백질 분해 효소를 순차적으로 처리하여 달성됩니다. ECM에서 분리된 세포는 기질 성분의 신생 합성(de novo synthesis)을 연구하기에 이상적입니다. 일부 저자들은 클로스트리디움 콜라게나제만 사용하는 반면, 다른 저자들은 연골을 트립신, 프로나제, DNase 및/또는 히알루로니다제와 함께 미리 배양합니다. 분리된 세포의 수는 사용된 효소에 따라 달라집니다. 따라서 콜라게나제만 처리하면 조직 1g에서 1.4~ ^{106개의 연골세포를 얻을 수 있는 반면, 프로나제, 히알루로니다제, 콜라게나제를 함께 처리하면 4.3~106개의} 연골세포 를 얻을 수 있습니다. 콜라게나제, 아그레칸, 단백질, IL-6, IL-8을 처리하면 다른 효소를 순차적으로 처리했을 때보다 세포 배양액에 훨씬 더 많은 양이 잔류합니다. 두 세포 배양액 간의 이러한 차이에 대한 몇 가지 설명이 있습니다.

• 세포 수용체는 효소에 의해 손상되거나 억제됩니다. TGF-베타는 갓 분리한 연골세포(1일차)에서 DNA 및 프로테오글리칸 합성을 억제하는 반면, 단층 배양(7일차)된 연골세포에서는 DNA 및 프로테오글리칸 합성이 TGF-베타에 의해 자극됩니다. 그러나 실험 시작 전 이러한 막 구성 요소의 재발현을 위한 충분한 시간이 필요합니다.
• 외인성 단백질 분해효소는 인테그린을 매개로 하는 세포-기질 상호작용을 방해할 수 있습니다. 인테그린 계열은 연골세포가 ECM 분자에 부착되는 것을 촉진합니다(Shakibaei M. et al., 1997). 이러한 방해는 기질 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다.
• 기질 성분의 잔여물은 연골세포의 합성 기능을 조절할 수 있다.인테그린은 ECM 분해 산물을 인식할 수 있으므로 단백질 분해 효소 작용 후 조직 복구에 중요한 역할을 한다.T. Larsson 등(1989)은 세포 배양액에 손상되지 않은 또는 단편화된 프로테오글리칸을 첨가하면 단백질과 프로테오글리칸의 합성이 자극된다고 보고했다.그러나 히알루론산 농도가 높으면 닭 배아의 연골세포, 돼지와 쥐 연골육종의 성숙 연골세포에서 프로테오글리칸 합성에 황산염이 포함되는 것이 크게 감소한다.게다가 히알루론산은 IL-1β, TNF-α, FGF가 존재하더라도 세포에서 프로테오글리칸 방출을 저해하는데, 이는 성장 인자와 사이토카인의 일차 생물학적 활성을 방해하는 작용을 나타낸다.히알루론산 작용의 정확한 기전은 아직 불분명하다. 연골세포는 세포질의 액틴 필라멘트와 연결된 히알루론산 수용체를 포함하는 것으로 알려져 있습니다. 히알루론산이 수용체에 결합하면 단백질 인산화가 촉진됩니다. 따라서 본 연구 결과는 기질 단백질의 단편화 또는 천연 분자가 세포막 수용체의 활성화를 통해 연골세포의 대사 기능을 조절함을 보여줍니다.
• 효소에 의한 연골세포의 기질 단백질 합성의 빠른 자극은 연골세포 모양의 변화 및/또는 세포골격 재편의 결과일 수 있습니다.
• 일부 사이토카인(예: IL-8)과 성장인자(예: IGF-1, TGF-β)는 ECM에 격리되어 있습니다. 가장 잘 알려진 예는 데코린에 의한 TGF-β의 결합으로, 중국 햄스터 난소 세포에서 데코린의 세포 성장 유도 능력이 감소하는 것으로 나타납니다. 연골의 데코린 함량이 연령에 따라 증가한다는 사실은 노화에 따른 TGF-β 생체이용률의 감소를 시사합니다. 성장인자와 사이토카인은 배양 중 기질 잔해로부터 방출되어 연골세포 기능을 조절할 수 있습니다.

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연골세포 단층 배양

연골세포의 분화된 표현형은 주로 II형 콜라겐과 조직 특이적 프로테오글리칸의 합성과 낮은 수준의 유사분열 활성을 특징으로 합니다.단일층에서 장기간 세포를 배양하고 여러 번 반복하여 세포를 계대 배양한 후 연골세포가 구형 윤곽을 잃고 길쭉한 섬유아세포와 같은 모양을 얻는다는 증거가 있습니다.이러한 섬유아세포 변성으로 인해 세포의 합성 기능도 변형되어 II, IX 및 XI형 콜라겐 합성이 점진적으로 감소하고 I, III 및 Y형 콜라겐 합성이 증가하는 것이 특징입니다.기능성 아그레칸으로 인해 작고 응집되지 않은 프로테오글리칸이 합성됩니다.카텝신 B와 L의 합성은 분화된 세포에서 극히 낮지만 분화 상실 과정에서 증가합니다.콜라게나제-1은 분화된 연골세포에서 발현됩니다. 장기간 배양하면 발현은 감소하는 반면, 금속단백분해효소 조직 억제제(TIMP)의 생성은 증가합니다.

분화된 연골세포는 단층 배양에서 부유 배양으로 옮겨질 때 분화된 표현형의 콜라겐을 재발현합니다. 분화 과정은 세포 모양과 관련이 있는 것으로 추정됩니다. 이러한 특성은 자가 연골세포를 이용한 결함 있는 이식편을 연구하는 연구자들이 흔히 활용합니다. 생검 조직에서 얻은 소수의 세포를 단층 배양에서 증식시킨 후, 이식 전에 3차원 매트릭스에 재도입할 수 있습니다. 아가로스 배양으로 옮겨진 역분화 연골세포의 특정 표현형 재발현은 TGF-β, 골수-수산화인회석 복합체, 그리고 아스코르브산에 의해 자극될 수 있습니다.

성장인자와 사이토카인에 반응하여 연골세포는 분화 과정에서 변형됩니다. 사이토카인과 성장인자에 대한 세포 반응은 미분화 연골세포와 분화 연골세포 간에 차이가 있습니다. IL-1은 섬유아세포 증식을 자극하는 반면, 미분화 연골세포의 성장은 IL-1에 의해 억제됩니다. DNA 합성은 길쭉하지만 납작하지 않은 연골세포에서 IGF-1에 의해 자극됩니다. 분화 연골세포에서 IL-1β와 TNF-α는 미분화 연골세포보다 프로콜라게나제 생성에 더 큰 영향을 미칩니다.

연골세포 배양

액체 배지 또는 천연 또는 합성 3차원 매트릭스에 연골세포를 현탁하여 배양하면 연골세포의 표현형이 안정화됩니다. 세포는 구형을 유지하고 조직 특이적 단백질을 합성합니다. 연골세포 현탁 배양은 일반적으로 새로운 세포주위 매트릭스 형성을 연구하는 데 권장됩니다. 합성 또는 천연 흡수성 중합체에서 연골세포를 배양하여 연골 결손 부위에 세포를 이식하여 관절 연골 조직의 재생을 촉진합니다. 이식된 세포에 사용되는 합성 또는 천연 배지는 다음과 같은 여러 요건을 충족해야 합니다.

• 임플란트는 세포 접착 및 성장을 위해 다공성 구조를 가져야 합니다.
• 폴리머 자체 또는 분해산물은 생체 내 이식 시 염증이나 독성 반응을 일으키지 않아야 합니다.
• 이식편 운반체는 인접한 연골이나 연골하골에 결합할 수 있는 능력이 있어야 합니다.
• 천연 또는 합성 매트릭스는 흡수 능력이 있어야 하며, 분해는 조직 재생을 통해 균형을 이루어야 합니다.
• 연골 수리를 용이하게 하기 위해 기질의 화학적 구조와 모공 구조는 그 안에 배치된 연골세포에 의한 세포 표현형의 유지와 조직 특이적 단백질의 합성을 용이하게 해야 합니다.
• 생체 내 이식 시에는 합성 또는 천연 기질의 기계적 특성을 연구하는 것이 필요합니다.

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액상 연골세포 현탁액

연골세포가 배양된 플라스틱 용기에 세포가 부착되는 것을 방지하기 위해 용기 벽을 메틸셀룰로오스, 아가로스, 하이드로젤(폴리-2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), 또는 콜라겐-아가로스 혼합물로 코팅할 수 있습니다. 이러한 조건에서 연골세포는 군집을 형성하고 주로 아그레칸(aggrecan)과 조직 특이적 콜라겐(II, IX, XI형)을 합성합니다. 일반적으로 두 가지 유형의 세포가 발견됩니다. 중앙에 위치한 세포는 구형을 유지하며 잘 발달된 세포외기질(ECM)로 둘러싸여 있는데, 이는 조직화학 및 미세구조 연구를 통해 확인됩니다. 주변부 연골세포는 원반형 윤곽을 가지며 드문드문한 세포외기질로 둘러싸여 있습니다. 이러한 세포의 기능적 특성에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.

현탁 상태로 유지되는 미세담체에서 연골세포를 배양할 수 있습니다. 미세담체로는 덱스트란 비드(사이토덱스), 콜라겐 코팅 덱스트란 비드(사이토덱스 III), 그리고 1형 콜라겐의 비다공성 미세구체(셀라젠)가 사용됩니다. 이러한 배양 조건에서 연골세포는 미세담체 표면에 부착되어 구형을 유지하며 기질과 유사한 물질을 생성합니다. 또한, 셀라젠은 연골세포의 증식과 정상 표현형의 재발현을 촉진합니다. 따라서, 셀라젠 미세구체에서 연골세포를 배양하면 이식 전 세포 표현형을 회복하는 데 도움이 될 수 있습니다.

^{액체 배지에서 연골세포 현탁액을 배양하는 또 다른 방법은 원심분리로 얻은 고밀도 세포 덩어리(0.5-1 x 10 b} ) 형태로 배양하는 것입니다. 이러한 연골세포는 다량의 프로테오글리칸과 II형 콜라겐을 함유한 기질을 생성할 수 있지만, I형 콜라겐은 생성할 수 없으며, 이는 조직학적, 면역조직화학적, 정량적 방법을 통해 확인되었습니다.

천연 ECM에 연골세포 현탁액

연골세포는 3차원 매트릭스(연성 아가, 아가로스, 콜라겐 젤 또는 스펀지, 히알루론산, 피브린 접착제, 알긴산염 비드)에 현탁하여 배양할 수 있습니다.

아가로스에서 배양된 연골세포는 정상적인 표현형을 유지하고 II형 콜라겐과 조직 특이적 아그레칸 응집체를 합성합니다. 아가로스에서 배양하면 세포에서 합성된 프로테오글리칸이 50일 동안 배지로 방출됩니다. 비교를 위해 단층 배양에서는 배양 초기 5~6일 동안 세포 단계가 이미 글리코사미노글리칸으로 과도하게 채워집니다. 배지에서 배양하면 초기 8~10일 동안 글리코사미노글리칸의 합성 및 방출이 증가한 후 시간 의존적으로 감소합니다. 그럼에도 불구하고 아가로스에서 배양된 연골세포의 행동은 생체 내와 다릅니다. 아가로스에서 합성된 많은 수의 아그레칸 응집체는 생체 내보다 분자가 작고 분자 수도 적습니다. TGF-β는 이식편에서 프로테오글리칸 합성을 자극하지만 아가로스에서는 아그레칸 합성을 감소시킵니다.

^{알지네이트는 갈조류에서 얻은 선형 다당류입니다. Ca 2+} 이온과 같은 2가 양이온이 존재할 경우, 이 중합체는 겔이 됩니다. 알지네이트에 갇힌 각 연골세포는 음전하를 띤 다당류 기질로 둘러싸여 있으며, 이 다당류의 기공은 유리 연골의 기공과 유사합니다. 알지네이트 비드에서 연골세포가 형성하는 기질은 두 개의 구획으로 구성됩니다. 관절 연골의 세포주위 및 영역 기질에 해당하는 얇은 세포 관련 기질층과, 자연 조직의 영역 간 기질에 해당하는 더 먼 기질층입니다. 배양 30일째, 알지네이트 비드에서 세포와 두 구획 각각이 차지하는 상대적 및 절대적 부피는 자연 연골의 부피와 거의 동일합니다. 연골세포는 거의 30일 동안 구형을 유지하고 아그레칸을 생성하는데, 이 아그레칸의 유체역학적 특성은 관절 연골 기질의 아그레칸 분자와 II, IX, XI형 콜라겐 분자와 유사합니다. 동시에, 다른 현탁 배양과 마찬가지로, 알지네이트 비드 표면에는 납작한 세포들이 존재하며, 이 세포들은 소량의 I형 콜라겐 분자를 생성하는데, 이 콜라겐 분자들은 배지로 직접 방출되어 세포외기질(ECM)에 흡수되지 않습니다. 알지네이트 비드에서 연골세포의 중간 정도의 증식이 관찰됩니다. 알지네이트 겔에서 8개월 동안 배양한 후에도, 성숙한 연골세포는 대사 활성을 잃지 않고 조직 특이적인 II형 콜라겐과 아그레칸을 계속 합성합니다.

H. Tanaka 외(1984)는 알지네이트에서 다양한 천연 분자의 확산 특성을 조사하여 70 kDa보다 큰 분자는 알지네이트를 통해 확산되지 않는다는 것을 발견했습니다. 따라서 알지네이트에서의 세포 배양은 기질 생합성 및 세포외 기질(ECM) 구성의 조절을 연구하는 데 적합합니다. 알지네이트에서 배양된 세포를 이용하면 전사, 전사후, 번역 단계에서 펩타이드 조절 인자와 약리학적 물질의 작용을 연구할 수 있습니다.

연골세포는 또한 I형 및 II형 콜라겐 섬유의 기질에서 배양됩니다.S. Nehrer 등(1997)은 다양한 유형의 콜라겐을 함유하는 다공성 콜라겐-프로테오글리칸 중합체 기질에서 개 연골세포의 기능을 비교했습니다.그들은 I형 및 II형 콜라겐을 함유하는 콜라겐 기질에서 배양된 연골세포의 생합성 기능의 형태에서 중요한 차이점을 발견했습니다.II형 콜라겐 기질의 세포는 구형을 유지한 반면, I형 콜라겐에서는 섬유아세포와 유사한 형태를 가졌습니다.게다가, II형 콜라겐 기질에서 연골세포는 더 많은 양의 글리코사미노글리칸을 생성했습니다.J. van Susante 등(1995)은 알긴산염과 콜라겐(I형) 젤에서 배양된 연골세포의 특성을 비교했습니다. 저자들은 콜라겐 겔에서 세포 수가 유의미하게 증가하였지만, 배양 6일째부터 세포들이 특유의 표현형을 잃고 섬유아세포 유사 세포로 변하는 것을 발견했습니다. 알긴산 겔에서는 세포 수가 감소하였지만, 연골세포는 정상적인 표현형을 유지했습니다. 콜라겐 겔에서는 세포당 프로테오글리칸 수가 알긴산보다 유의미하게 높았지만, 겔에서는 배양 6일째부터 기질 성분의 합성이 감소한 반면, 알긴산에서는 합성이 지속적으로 증가하는 것으로 관찰되었습니다.

고체 3차원 피브린 기질은 분화된 표현형으로 그 안에 부유하는 연골세포를 지지하는 천연 물질입니다. 3차원 피브린 기질은 연골세포 이식 시 운반체로도 사용될 수 있습니다. 피브린의 장점은 세포독성이 없고, 공간을 채울 수 있으며, 접착력이 우수하다는 것입니다. 조직학적, 생화학적 연구, 자가방사선촬영, 전자현미경 검사 결과, 피브린 겔에 있는 연골세포는 2주 배양 후에도 형태를 유지하고 증식하며 기질을 생성하는 것으로 나타났습니다. 그러나 G. Homminga 등(1993)은 배양 3일 후부터 피브린 분해가 시작되고 연골세포의 탈분화가 진행된다고 보고했습니다.

인공(합성) ECM에 연골세포 현탁

재건 수술이나 정형외과 수술을 위한 연골 임플란트는 합성 생체적합성 매트릭스에서 분리된 연골세포를 시험관 내에서 배양하여 얻을 수 있습니다.

폴리글리콜산에서 배양된 연골세포는 8주 동안 증식하고 정상적인 형태와 표현형을 유지합니다. 연골세포-폴리글리콜산 복합체는 세포, 글리코사미노글리칸, 콜라겐으로 구성되며 외부에 콜라겐 피막이 있습니다. 그러나 이러한 임플란트는 I형과 II형의 두 가지 유형의 콜라겐 분자를 함유합니다. 일련의 계대배양을 통해 역분화된 연골세포에서 유래한 임플란트는 미분화된 연골세포에서 유래한 임플란트보다 글리코사미노글리칸과 콜라겐 함량이 더 높습니다.

L. Freed 등(1993b)은 섬유성 폴리글리콜산(FPGA)과 다공성 폴리락트산(PPLA)에서 인간과 소 연골세포 배양액의 거동을 비교했습니다. 저자들은 소 연골세포를 FPGA 또는 PPLA에서 6~8주 동안 배양한 후, 세포 증식과 연골 기질의 재생을 관찰했습니다. FPGA에서 연골세포는 구형이었고 연골 기질로 둘러싸인 공동(lacunae)에 위치했습니다. 8주간의 체외 배양 후, 재생된 조직은 최대 50%의 건조 물질(세포질량 4%, 글리코사미노글리칸 15%, 콜라겐 31%)을 함유했습니다. PPLA에서 세포는 방추형이었고 소량의 글리코사미노글리칸과 콜라겐을 함유했습니다. FPGA에서 세포 성장은 PPLA보다 2배 더 강했습니다. 생체 내 실험에서, VPGK와 PPLC에서 배양된 연골세포는 1~6개월 이내에 연골과 조직학적으로 유사한 조직을 형성했습니다. 임플란트에는 글리코사미노글리칸, I형 및 II형 콜라겐이 함유되어 있습니다.

소 태아 연골세포를 다공성 고밀도 소수성 및 친수성 폴리에틸렌에서 배양하였다. 두 기질 모두에서 7일간 배양한 후, 세포는 구형을 유지하였고 주로 II형 콜라겐을 함유하였다. 21일 배양 후, 친수성 기질이 소수성 기질보다 II형 콜라겐을 더 많이 함유하는 것으로 나타났다.

연골 조직은 Millicell-CM 필터에서 단층으로 배양하여 얻을 수도 있습니다. 콘드로이틴 부착을 위해 필터를 콜라겐으로 미리 코팅하는 것이 필수적입니다. 배양액의 조직학적 검사 결과, 프로테오글리칸과 II형 콜라겐을 함유하는 ECM에 연골세포가 축적된 것으로 나타났습니다. 이러한 배양액에서는 I형 콜라겐이 검출되지 않았습니다. 얻어진 연골 조직의 연골세포는 구형이지만, 조직 표면에서는 다소 납작한 형태를 보입니다. 새로 형성된 조직의 두께는 시간이 지남에 따라 증가했으며, 이는 세포 단층의 초기 밀도에 따라 결정되었습니다. 최적의 배양 조건에서 연골 조직의 두께는 110μm에 달했으며, 세포와 콜라겐의 표층 및 심층 조직 구성은 관절 연골과 유사했습니다. ECM은 콜라겐과 프로테오글리칸을 약 3배 더 많이 함유하고 있습니다. 배양 2주 후, 기질 축적이 관찰되어 필터에서 조직을 추출하여 이식에 사용할 수 있었습니다.

Sims 등(1996)은 폴리에틸렌 옥사이드 겔에서 연골세포를 배양하는 방법을 연구했습니다. 폴리에틸렌 옥사이드 겔은 주입을 통해 다량의 세포를 이식할 수 있는 캡슐화된 고분자 매트릭스입니다. 무흉선 마우스의 피하 조직에 주입한 지 6주 후, 새로운 연골이 형성되었으며, 형태학적으로는 유리 연골과 유사한 백색 유백색을 띠었습니다. 조직학적 및 생화학적 데이터는 ECM을 생성하는 활발하게 증식하는 연골세포의 존재를 시사했습니다.

설명

연골 조직의 절제는 연골 조직 내의 동화작용 및 이화작용, 항상성 유지, 흡수 및 복구 과정을 연구하는 데 사용됩니다. 연골 절제물의 연골 세포는 생체 내 관절 연골과 유사한 정상적인 표현형과 ECM 구성을 유지합니다. 혈청 존재 하에 5일 동안 배양하면 일정한 수준의 합성 및 자연적 분해 과정이 달성됩니다. IL-IB, TNF-α, 박테리아 리포폴리사카라이드, 레티노산 유도체 또는 활성 산소 라디칼과 같은 여러 가지 물질을 사용하여 주 배양 및 혈청을 첨가한 배양에서 조직 흡수를 가속화할 수 있습니다. 연골 복구를 연구하기 위해 가용성 염증 매개체(H ₂ O ₂, IL-1, TNF-α) 또는 기질의 물리적 파열에 의해 손상이 유도됩니다.

기관형 배양법은 연골세포와 주변 기질에 대한 분리된 외부 요인의 영향을 시험관 내에서 연구하는 모델입니다. 생체 내에서 연골세포는 세포외 기질(ECM) 내에 희박하게 위치하며 서로 접촉하지 않습니다. 관절 연골 이식편 배양은 이러한 구조적 조직뿐만 아니라 연골세포와 주변 세포외 환경 간의 특이적인 상호작용을 보존합니다. 이 모델은 기계적 스트레스, 약리학적 물질, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬이 연골 대사에 미치는 영향을 연구하는 데에도 사용됩니다.

연골 조직 제거술의 또 다른 장점은 세포 분리 시 불가피하게 발생하는 단백질 분해 효소나 기계적 요인의 작용으로 인한 연골세포 손상이 없다는 것입니다. 수용체와 기타 막 단백질 및 당단백질은 손상 요인으로부터 보호됩니다.

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콘드론 배양

연골은 관절 연골의 구조적, 기능적, 대사적 단위로, 연골세포, 세포주위 기질, 그리고 치밀한 필라멘트 피막으로 구성되며 기질 항상성을 담당합니다. 연골은 연골에서 기계적으로 추출하여 여러 차례의 저속 균질화를 통해 수집합니다. 연골 깊이가 서로 다른 구역에서 분리한 연골은 단일 연골, 쌍 연골, 여러 개(세 개 이상)의 선형으로 배열된 연골(연골 기둥), 그리고 연골 덩어리의 네 가지 유형으로 나눌 수 있습니다.

단일 콘드론은 일반적으로 온전한 연골의 중간층에서 발견되고, 쌍을 이룬 콘드론은 중간층과 심부층의 경계에서 발견되며, 선형으로 배열된 여러 개의 콘드론은 온전한 연골의 심부층에서 일반적입니다. 마지막으로, 콘드론 클러스터는 단일 및 쌍을 이룬 콘드론이 무작위로 구성된 그룹으로 구성되며, 균질화 후에도 응집된 상태를 유지합니다. 콘드론 클러스터는 연골의 큰 조각으로, 일반적으로 여러 개의 콘드론과 방사형으로 배열된 콜라겐 섬유를 포함합니다. 즉, 기질의 심부층에서 일반적으로 나타나는 조직적 특징입니다. 콘드론은 투명한 아가로스에 고정되어 구조, 분자 구성 및 대사 활성을 연구할 수 있습니다. 콘드론-아가로스 시스템은 연골의 미세모형으로 간주되며, 자연적인 미세환경이 보존되어 합성 및 조립이 필요 없다는 점에서 기존의 연골세포-아가로스 시스템과 다릅니다. 연골 배양은 정상 및 병적인 조건에서 관절 연골의 세포와 기질의 상호작용을 연구하기 위한 모델입니다.

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불멸 연골세포 배양

세포를 "불멸"로 만들 수 있는 재조합 DNA 또는 종양유전자를 포함하는 바이러스는 영구 세포주를 만드는 데 사용됩니다. 불멸 연골세포는 안정적인 표현형을 유지하면서 무한히 증식할 수 있습니다. F. Mallein-Gerin 외(1995)는 SV40T 종양유전자가 마우스 연골세포의 증식을 유도하며, 이 세포는 II형, IX형, XI형 콜라겐과 관절 아그레칸 및 결합 단백질을 안정적으로 발현함을 보였습니다. 그러나 이러한 세포주는 단층 배양이나 아가로스 겔에서 배양하면 I형 콜라겐을 합성할 수 있는 능력을 얻게 됩니다.

W. Horton 외(1988)는 II형 콜라겐 mRNA 발현 수준이 낮은 불멸 세포주를 연구했습니다. 이 세포들은 I-myc 및 y-ra 종양유전자를 포함하는 마우스 레트로바이러스로 형질전환하여 얻었습니다. 이러한 유형의 세포는 II형 콜라겐이 없는 상태에서 관절 기질의 상호작용과 II형 콜라겐 합성 조절을 연구하는 데 있어 독특한 모델이 됩니다.

돌연변이 또는 삭제된 유전자를 가진 연골세포 배양은 연골세포의 생리적 기능을 연구하는 데 편리한 모델입니다. 이 모델은 특히 연골 기질의 구성에서 특정 분자의 역할을 연구하거나 연골 대사에 대한 다양한 조절 인자의 영향을 조사하는 데 적합합니다. IX형 콜라겐 유전자가 삭제된 연골세포는 정상보다 더 넓은 콜라겐 섬유를 합성하는데, 이는 IX형 콜라겐이 섬유의 직경을 조절함을 시사합니다. 1장에서 언급했듯이, 최근 원발성 전신성 골관절염을 가진 가족에서 II형 콜라겐을 암호화하는 COLAI 유전자의 돌연변이가 발견되었습니다. 돌연변이된 II형 콜라겐이 관절 기질에 미치는 영향을 연구하기 위해 R. Dharmrvaram 등(1997)은 결함이 있는 COL ₂ AI(519번 위치의 아르기닌이 시스테인으로 대체됨)를 시험관 내에서 인간 태아 연골세포에 형질감염(이물질 핵산으로 감염)시켰습니다.

공동배양 시스템. 관절에서 연골은 활막, 활액, 인대, 그리고 연골하골에 포함된 다른 세포들과 상호작용합니다. 연골세포의 대사는 나열된 세포들이 합성하는 다양한 용해성 인자의 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 관절염에서 관절 연골은 활막 세포에서 생성되는 단백질 분해 효소와 자유 라디칼에 의해 파괴됩니다. 따라서 연골과 주변 조직 간의 복잡한 상호작용을 연구하기 위한 모델이 개발되었는데, 이를 공동배양이라고 합니다.

S. Lacombe-Gleise 외(1995)는 토끼 연골세포와 골모세포를 공동배양 시스템(COSTAR)에서 배양했습니다. 이 시스템에서는 세포들이 미세다공성 막(0.4 μm)으로 분리되어 직접적인 접촉 없이 두 세포 유형 간의 교환이 가능했습니다. 이 연구는 골모세포가 가용성 매개체를 통해 연골세포 성장을 자극하는 능력을 입증했습니다.

AM Malfait 외 공동 연구진(1994)은 말초혈액 단핵구와 연골세포 간의 관계를 연구했습니다. 이 모델은 염증성 관절병증(류마티스 관절염, 혈청 음성 척추관절염 등)에서 사이토카인 매개 과정을 연구하는 데 유용합니다. 이 모델의 저자들은 직경 0.4μm의 기공을 가진 단백질 결합막으로 세포를 분리했습니다. 이 연구는 리포폴리사카라이드로 자극받은 단핵구가 IL-1과 TNF-α를 생성하여 연골세포의 아그레칸 합성을 억제하고 이미 합성된 아그레칸 응집체의 분해에 기여함을 보여주었습니다.

K. Tada 외(1994)는 콜라겐(1형) 겔 내피세포를 0.4μm 기공 크기의 필터를 통해 연골세포가 위치한 외측 챔버와 분리된 내측 챔버에 배치하는 공동배양 모델을 개발했습니다. 외측 챔버와 완전히 분리된 상태에서, 인간 내피세포는 EGF 또는 TGF-α 존재 하에 콜라겐 겔 내에서 관을 형성했습니다. 두 유형의 세포를 동시에 배양했을 때, 내피세포의 TGF-α 의존성 관 형성이 억제되었습니다. 연골세포에 의한 이러한 과정의 억제는 항-TGF-β 항체에 의해 부분적으로 제거되었습니다. 이는 연골세포에서 생성되는 TGF-β가 연골 자체의 혈관 생성을 억제하는 것으로 추정할 수 있습니다.

S. Groot 등(1994)은 16일 된 생쥐 태아의 비대 및 증식대에서 채취한 연골세포를 뇌 조직 조각과 동시에 배양했습니다. 배양 4일 후, 연골세포가 골모세포로 전환분화되고 유골 형성이 시작되는 것을 관찰했습니다. 배양 11일 후, 연골의 일부가 골 조직으로 대체되었고 골 기질은 부분적으로 석회화되었습니다. 뇌 조직에서 생성되는 일부 신경펩타이드와 신경전달물질은 골모세포의 대사에 영향을 미치거나 이에 대한 수용체를 가지고 있습니다. 여기에는 노르에피네프린, 혈관활성 장 펩타이드, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 물질 P, 소마토스타틴이 있습니다. 연골세포와 함께 배양된 뇌 조직 조각은 연골세포가 골모세포로 전환분화 과정을 유도할 수 있는 나열된 인자들을 생성할 수 있습니다.

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연골세포 배양에 대한 외부 요인의 영향

산소 긴장도가 연골세포 대사에 미치는 영향

대부분의 경우, 연골세포 배양은 대기압 산소 분압 조건에서 진행됩니다. 그러나 생체 내 연골세포는 저산소 상태에서 존재하며, 다양한 병리학적 조건에서 산소 분압이 변한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 성숙 과정에서 골단으로의 혈액 공급에 상당한 변화가 관찰됩니다. 성장판의 각 영역에서 혈관 형성이 다르기 때문에 각 영역의 산소 분압 또한 다릅니다. C. Brighton과 R. Heppenstall(1971)은 토끼의 경골판에서 비대 영역의 산소 분압이 주변 연골보다 낮음을 보였습니다. 일부 대사 지표를 측정한 결과, 연골세포는 국소적인 산소 농도 변화에 빠르게 반응할 수 있음을 보여주었습니다. 첫째, 낮은 산소 분압에서는 연골세포의 산소 소비가 감소합니다. 산소 분압이 21%에서 0.04%로 감소하면 포도당 이용률이 증가하고 해당분해 효소의 활성과 젖산 합성이 증가합니다. 낮은 산소 분압에서도 ATP, ADP, AMP의 절대량은 안정적으로 유지됩니다. 이러한 데이터는 연골세포 대사가 최대 에너지 보존을 목표로 한다는 것을 시사합니다. 그러나 저산소 조건에서는 합성 활동, 즉 회복 과정이 변화합니다.

높은 산소 분압은 연골세포 대사에도 영향을 미쳐 프로테오글리칸과 DNA 합성을 감소시키고 연골 기질을 분해합니다. 이러한 영향은 일반적으로 활성산소 생성을 동반합니다.

환경의 이온 농도와 삼투압이 연골세포 기능에 미치는 영향

천연 연골에서 이온 농도는 다른 조직과 현저히 다릅니다. 세포외 배지의 나트륨 함량은 250~350mmol이고, 삼투압은 350~450mosmol입니다. 연골세포를 세포외 기질에서 분리하여 표준 배지(DMEM, 둘베코 최소 필수 배지, 삼투압 250~280.7mosmol)에서 배양하면 세포 주변 환경이 크게 변합니다. 또한, 표준 배지의 칼슘과 칼륨 농도는 천연 조직보다 현저히 낮고, 음이온 농도는 현저히 높습니다.

배지에 수크로오스를 첨가하면 삼투압이 증가하고 세포질 내 H ^{+ 및 칼슘 음이온 농도의 일시적인 세포 내 증가가 유도됩니다. 이러한 세포 내 변화는 연골세포 분화 과정과 대사 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. J. Urban et al. (1993)은 표준 DMEM에서 2~4시간 동안 배양한 분리된 연골세포에 의한35,8-} 황산염 및 ^3H- 프롤린의 혼입이 천연 조직의 10%에 불과하다는 것을 발견했습니다. 합성 강도는 신선하게 분리된 연골세포와 연골 조직 이식편 모두에서 세포외 배지의 삼투압이 350~400 mosmol일 때 최대에 도달했습니다. 또한, 분리된 세포를 지정된 삼투압의 표준 DMEM에 넣은 후 연골세포의 양이 30~40% 증가했습니다. 그러나 비생리적 삼투압 조건에서 연골세포를 12~16시간 동안 배양하면 세포가 새로운 조건에 적응하여 세포 밖 환경의 삼투압 변화에 비례하여 생합성 강도가 감소합니다.

P. Borgetti 등(1995)은 세포외 배지의 삼투압이 돼지 연골세포의 성장, 형태 및 생합성에 미치는 영향을 연구했습니다. 저자들은 삼투압이 0.28 및 0.38 mosmol인 배지에서 배양된 연골세포에서 유사한 생화학적 및 형태학적 특성을 보였습니다. 삼투압이 0.48 mosmol인 배지에서 배양 후 처음 4~6시간 동안 세포 증식과 단백질 합성이 감소했지만, 이후 회복되어 결국 대조군에 도달했습니다. 삼투압이 0.58 mosmol인 배지에서 연골세포를 배양했을 때, 세포는 증식 과정의 생리적 강도를 유지하는 능력을 상실했으며, 6일 후에는 연골세포 수가 현저히 감소했습니다. 삼투압이 0.58 mosmol인 배지에서 배양했을 때, 단백질 합성의 심각한 억제가 관찰되었습니다. 또한, 0.28-0.38 mOsm의 삼투압 농도를 갖는 배지에서 배양할 경우 연골세포는 생리적 표현형을 유지하지만, 더 높은 삼투압 농도(0.48-0.58 mOsm)에서는 세포 형태에 유의미한 변화가 나타나며, 이는 특징적인 표현형의 소실, 연골세포가 섬유아세포 유사 세포로의 전환, 그리고 세포가 기질 프로테오글리칸을 조립하는 능력의 상실로 나타납니다. 본 연구 결과는 연골세포가 세포외 환경의 삼투압 농도의 제한된 변동에 반응할 수 있음을 시사합니다.

다른 이온의 농도 변화도 연골세포의 생합성 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 칼륨 이온 농도가 5mmol(표준 DM EM 배지의 농도)에서 10mmol(생체 내 ECM의 농도)로 증가함에 따라 35S(황산염)의 ^흡수 정도는 절반으로 증가합니다. 0.5mmol 미만의 칼슘 농도는 성숙한 소 연골세포의 콜라겐 생성을 촉진하는 반면, 1-2mmol(표준 DM EM 배지의 농도에 해당) 농도는 콜라겐 합성을 유의미하게 감소시켰습니다. 높은 칼슘 농도(2-10mmol)에서는 생합성이 적당히 증가하는 것으로 관찰되었습니다. 다양한 양이온이 연골세포가 ECM 단백질에 부착하는 데 관여합니다. 따라서 마그네슘과 망간 이온은 피브로넥틴과 II형 콜라겐에 부착하는 반면, 칼슘 이온은 연골세포가 단백질에 부착하는 데 관여하지 않습니다. 따라서 설명된 연구의 결과는 표준 배지에서 배양된 연골세포의 생합성 기능에 대한 배지의 삼투압 농도, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 세포외 이온의 변화에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다.

연골세포 대사에 대한 기계적 스트레스의 영향

관절 고정은 가역적인 연골 위축을 유발하며, 이는 세포외 기질(ECM)의 정상적인 대사 과정에 기계적 자극이 필요함을 시사합니다. 대부분의 경우, 사용된 세포 배양 모델은 정상 대기압 하에서 배양됩니다. M. Wright 등(1996)은 기계적 환경이 연골세포 대사에 영향을 미치며, 세포 반응은 압축 하중의 강도와 빈도에 따라 달라진다는 것을 보여주었습니다. 온전한 관절 연골의 절편체에 대한 시험관 내 하중 실험에서 정적 하중은 단백질과 프로테오글리칸 합성을 감소시키는 반면, 동적 하중은 이러한 과정을 자극하는 것으로 나타났습니다. 연골에 대한 기계적 하중의 정확한 메커니즘은 복잡하며, 세포 변형, 정수압, 삼투압, 전위, 그리고 기질 분자에 대한 표면 세포 수용체와 관련이 있는 것으로 추정됩니다. 이러한 각 변수의 영향을 연구하려면 하나의 변수를 독립적으로 조절할 수 있는 시스템을 구축해야 합니다. 예를 들어, 절편체 배양은 세포 변형 연구에는 적합하지 않지만, 연골세포의 대사 활동에 대한 압력의 전반적인 영향을 연구하는 데에는 사용할 수 있습니다. 연골의 압박은 세포 변형을 유발하며, 정수압 구배, 전위, 유체 흐름, 그리고 기질 내 수분 함량, 전하 밀도, 삼투압 수준과 같은 물리화학적 매개변수의 변화를 동반합니다. 세포 변형은 아가로스 또는 콜라겐 젤에 담근 분리 연골세포를 이용하여 연구할 수 있습니다.

연골세포 배양에 대한 기계적 자극의 영향을 연구하기 위해 여러 시스템이 개발되었습니다. 일부 연구자들은 기체 상태를 통해 세포 배양액에 압력을 가하는 시스템을 사용합니다. 따라서 JP Veldhuijzen 등(1979)은 대기압보다 13 kPa 높은 압력을 저주파(0.3 Hz)로 15분 동안 가했을 때 cAMP와 프로테오글리칸 합성이 증가하고 DNA 합성이 감소하는 것을 관찰했습니다. R. Smith 등(1996)은 일차 소 연골세포 배양액을 1Hz 주파수의 정수압(10 MPa)에 4시간 동안 간헐적으로 노출시켰을 때 아그레칸과 II형 콜라겐 합성이 증가했지만, 일정한 압력은 이러한 과정에 영향을 미치지 않았음을 보였습니다. 유사한 시스템을 사용하여 Wright 등(1996)은 세포 배양액에 대한 주기적 압력이 연골세포 세포막의 과분극 및 Ca ²⁺ 의존성 칼륨 채널의 활성화와 관련이 있다고 보고했습니다. 따라서, 주기적 압력의 효과는 연골세포막의 신축 활성화 이온 채널에 의해 매개됩니다. 정수압에 대한 연골세포의 반응은 세포 배양 조건과 가해지는 하중의 주파수에 따라 달라집니다. 따라서, 주기적 정수압(5 MPa)은 0.05, 0.25, 0.5 Hz의 주파수에서 연골세포 단층으로의 황산염 유입을 감소시키는 반면, 0.5 Hz보다 높은 주파수에서는 연골 이식편으로의 황산염 유입이 증가합니다.

M. Bushmann 외(1992)는 아가로스 겔에서 연골세포가 정적 및 동적 기계적 부하에 반응하여 생합성을 변화시키는데, 이는 배양된 정상 장기와 동일한 방식이라고 보고했습니다. 저자들은 기계적 부하가 연골세포의 고삼투압 자극을 유발하여 pH를 감소시킨다는 것을 발견했습니다.

기계적 스트레칭의 효과는 겔에 담긴 세포 배양에서 연구될 수 있다. 스트레칭 힘은 컴퓨터로 제어되는 진공을 사용하여 생성할 수 있다. 시스템이 특정 진공 상태에 있을 때, 세포 배양액이 있는 페트리 접시의 바닥은 알려진 양만큼 늘어나고, 변형은 접시 바닥의 가장자리에서 최대이고 중앙에서 최소이다. 스트레칭은 또한 페트리 접시에서 배양된 연골 세포로 전달된다. 이 방법을 사용하여, K. Holm-vall 등(1995)은 콜라겐(유형 II) 겔에서 배양된 연골육종 세포에서 2β-인테그린 mRNA의 발현이 증가한다는 것을 보였다 _{. 2β인테그린은} 유형 II 콜라겐에 결합 할 _{수 있다}. 그것은 액틴 결합 단백질과 상호 작용하여 ECM과 세포골격을 연결하기 때문에 기계적 수용체로 간주된다.

PH가 연골세포 대사에 미치는 영향

연골 조직의 ECM 간질액의 pH는 다른 조직보다 더 산성입니다. A. Maroudas(1980)는 관절 연골 기질의 pH를 6.9로 측정했습니다. B. Diamant 등(1966)은 병적인 조건에서 pH가 5.5임을 확인했습니다. 연골세포는 낮은 PO₂(산소분압)에서 생존하는 것으로 알려져 있는데, 이는 연골세포 대사에서 해당과정(전체 포도당 대사의 95%)이 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 해당과정은 다량의 젖산 생성을 동반합니다.

해당분해 생성물에 의한 환경의 산성화 외에도 기질 성분 자체가 매우 중요합니다.프로테오글리칸의 많은 양의 고정된 음전하는 세포외 이온 구성을 변형합니다.높은 농도의 자유 양이온(예: H ⁺, Na ⁺, K ⁺ )과 낮은 농도의 음이온(예: O2, HCO3)이 관찰됩니다.또한 기계적 부하의 영향으로 물이 ECM에서 배출되어 고정된 음전하의 농도가 증가하고 더 많은 양이온이 기질로 끌립니다.이와 함께 세포외 환경의 pH가 감소하여 세포내 pH에 영향을 미쳐 연골세포의 대사가 변형됩니다.R. Wilkin과 A. Hall(1995)은 분리된 소 연골세포의 기질 생합성에 대한 세포외 및 세포내 환경의 pH의 영향을 연구했습니다.그들은 pH가 감소함에 따라 기질 합성이 이중으로 변형되는 것을 관찰했습니다. pH를 약간 낮추면(7.435 SO ₄ 와 ³ H-프롤린이 연골세포로 유입되는 것이 50% 증가했지만, 배지를 더 산성화하면(pH<7.1) 대조군에 비해 합성이 75% 억제되었습니다. 암모늄 이온을 사용하여 낮은 pH(6.65)를 만들면 기질 합성이 20%만 감소했습니다. 이러한 결과는 세포외 배지의 pH 변화에 따른 기질 합성이 세포내 배지의 pH 변화만으로는 설명될 수 없음을 시사합니다. 더욱이, 연골세포는 Na ⁺, H ^{+ -} 교환체, Ka ^{+ -} 의존성 Cl ^- -НСОС3 -수송체, 그리고 H ⁺ /ATPase를 이용하여 세포내 pH를 조절하는 능력을 가지고 있습니다.

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배양액 조성이 연골세포 대사에 미치는 영향

연골세포 배양 배지는 실험 조건에 부합해야 합니다. 최근에는 배양 조건을 최적화하기 위해 송아지 혈청을 사용해 왔습니다. 하지만 혈청을 사용할 때는 몇 가지 중요한 사항을 고려해야 합니다.

• 장기 배양에서 조직 주변에서 세포가 바깥쪽으로 성장하는 것
• 다양한 시리즈의 혈청 구성의 다양성,
• 그 안에 알려지지 않은 성분이 존재함
• 세포의 대사 활동에 대한 다양한 생물학적 요인의 영향을 연구할 때 간섭과 인공물의 위험이 증가합니다.

후자의 예로는 쥐의 연골세포에 대한 EGF의 효과를 연구한 연구가 있습니다. EGF는 3H-티미딘의 결합을 촉진 ^하고 배양액 내 DNA 함량을 증가시켰습니다. 이러한 효과는 낮은 혈청 농도(<1%)에서 더욱 두드러졌지만, 고농도(>7.5%)에서는 효과가 사라졌습니다.

송아지 혈청이 보충된 DMEM에서 합성 및 분해 수준이 생체 내 조건에 비해 상당히 증가한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 생체 내와 시험관 내 대사 간의 차이는 활액액과 세포가 배양된 배지 간의 차이 때문일 수 있습니다. Lee 등(1997)은 20% 송아지 혈청과 많은 양의 정상 동종 활액액이 보충된 DMEM을 함유한 영양 배지를 사용하여 아가로스에서 어린 소 연골 세포를 배양했습니다. 배지에 활액액이 존재하면 프로테오글리칸 양이 활액액 총량의 최대 80%까지 증가합니다. 이러한 결과는 배양된 활액액이 글리코사미노글리칸 합성 수준이 높고 세포 분열 수준이 낮은 생체 내와 유사한 대사 수준을 유도함을 나타냅니다.

G. Verbruggen 등(1995)은 무혈청 DMEM에서 아가로스로 배양된 인간 연골세포에 의한 ³⁵ S-arrpeKaHa 합성이 10% 송아지 혈청이 보충된 DMEM에서 관찰된 합성 수준의 20-30%임을 보여주었습니다. 저자들은 무혈청 배지에서 IGF-1, IGF-2, TGF-R 또는 인슐린이 아그레칸 생성을 어느 정도 회복시키는지 확인했습니다. 저자들은 100 ng/ml 인슐린, IGF-1 또는 IGF-2가 아그레칸 합성을 대조군 수준의 39-53%로 부분적으로 회복시켰다고 결론지었습니다. 나열된 요인의 조합에서는 상승작용이나 누적이 관찰되지 않았습니다. 동시에, 100 ng/ml 인슐린이 존재하는 10 ng/ml TGF-R은 아그레칸 합성을 기준 수준의 90% 이상으로 자극했습니다. 마지막으로, 인간 혈청 트랜스페린은 단독으로 또는 인슐린과 함께 사용 시 아그레칸 합성에 영향을 미치지 않았습니다. 송아지 혈청을 소 혈청 알부민으로 대체했을 때 아그레칸 응집체 함량이 유의하게 감소했습니다. 배양 배지에 인슐린, IGF 또는 TGF-R을 첨가하면 세포의 아그레칸 응집체 생성 능력이 부분적으로 회복되었습니다. 더욱이, IGF-1과 인슐린은 세포 배양 시 항상성을 유지할 수 있습니다. 10-20 ng/ml의 IGF-1이 풍부한 배지에서 40일 동안 배양한 후, 프로테오글리칸 합성은 20% 송아지 혈청이 포함된 배지와 동일하거나 더 높은 수준으로 유지되었습니다. 이화 과정은 0.1% 알부민 용액이 풍부한 배지보다 IGF-1이 풍부한 배지에서 더 느리게 진행되었지만, 20% 혈청이 풍부한 배지에서는 다소 빠르게 진행되었습니다. 장수 배양에서 20 ng/ml의 IGF-1은 세포의 안정된 상태를 유지합니다.

D. Lee 등(1993)은 연골 조직 이식편 배양, 단층 배양 및 아가로스 현탁액에서 배양 배지 조성(DMEM, DMEM+20% 송아지 혈청, DMEM+20 ng/ml IGF-1)이 DNA 합성에 미치는 영향을 비교했습니다. 혈청이 있는 아가로스에서 배양할 때, 저자들은 연골세포가 큰 덩어리로 모이는 경향을 관찰했습니다. 혈청 없이 또는 IGF-1과 함께 배양한 세포는 아가로스에서 둥근 모양을 유지했고, 작은 그룹으로 모였지만 큰 응집체를 형성하지 않았습니다. 단층에서 DNA 합성은 IGF-1이 풍부한 배지보다 혈청이 포함된 배지에서 유의하게 높았습니다. 후자의 DNA 합성은 비강화 배지보다 유의하게 높았습니다. 연골세포를 비강화 배지의 아가로스 현탁액과 IGF-1이 있는 배지에서 배양했을 때 DNA 합성에 차이가 발견되지 않았습니다. 동시에, 혈청이 풍부한 배지에서 아가로스로 연골세포 현탁액을 배양하면 다른 배지에 비해 방사성 뉴클레오타이드 ^{3H- 티미딘의 첨가량이 증가했습니다.}

비타민 C는 콜라겐 섬유의 안정적인 나선형 구조 형성에 관여하는 효소의 활성화에 필수적입니다. 아스코르브산이 결핍된 연골세포는 수산화가 부족한 비나선형 콜라겐 전구체를 합성하며, 이는 느리게 분비됩니다. 아스코르브산(50 μg/ml)을 투여하면 II형 및 IX형 콜라겐의 수산화가 일어나고 정상량으로 분비됩니다. 비타민 C 첨가는 프로테오글리칸 합성 수준에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서 콜라겐 분비는 프로테오글리칸 분비와 독립적으로 조절됩니다.

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