인공 심장 판막

폐 자가이식을 제외하고 임상적으로 사용 가능한 현대의 생물학적 인공 심장 판막은 성장 및 조직 재생 가능성이 부족한 비생존성 구조입니다. 이는 특히 소아의 판막 병변 교정에 있어 상당한 제약을 가합니다. 조직 공학은 지난 15년 동안 발전해 왔습니다. 이 과학적 방향의 목표는 혈전 저항성 표면과 생존 가능한 간질을 가진 인공 심장 판막과 같은 구조를 인공적인 조건에서 만드는 것입니다.

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인공심장판막은 어떻게 개발되나요?

조직공학의 과학적 개념은 합성 또는 천연 흡수성 스캐폴드(매트릭스)에 살아있는 세포(섬유아세포, 줄기세포 등)를 채우고 성장시키는 아이디어에 기초합니다. 이 스캐폴드는 3차원 밸브 구조이며, 세포외 기질이 형성되는 동안 이식된 세포의 유전자 발현, 조직화 및 생산성을 조절하는 신호를 사용합니다.

이러한 인공 심장 판막은 구조와 기능의 최종적인 복원 및 유지를 위해 환자 조직과 통합됩니다. 이 경우, 세포(섬유아세포, 근섬유아세포 등)의 기능 작용으로 인해 원래 기질 위에 새로운 콜라겐-엘라스틴 골격, 더 정확히는 세포외 기질이 형성됩니다. 따라서 조직 공학을 통해 만들어진 최적의 인공 심장 판막은 해부학적 구조와 기능 측면에서 원래의 판막과 유사해야 하며, 생체역학적 적응성, 회복 및 성장 능력도 가져야 합니다.

조직공학은 다양한 세포 채취원을 이용하여 인공 심장판막을 개발합니다. 이종 세포나 동종이계 세포를 사용할 수 있지만, 전자는 인수공통전염병(zoonoses)을 인간에게 전파할 위험이 있습니다. 동종이계 세포의 유전자 변형을 통해 항원성을 감소시키고 신체 거부 반응을 예방할 수 있습니다. 조직공학에는 신뢰할 수 있는 세포 공급원이 필요합니다. 이러한 공급원은 환자로부터 직접 채취한 자가 세포이며, 재이식 시 면역 반응을 일으키지 않습니다. 효과적인 인공 심장판막은 혈관(동맥과 정맥)에서 채취한 자가 세포를 기반으로 제작됩니다. 순수 세포 배양을 위해 형광활성세포분류법(FACS)을 이용한 방법이 개발되었습니다. 혈관에서 채취한 혼합 세포 집단을 아세틸화된 저밀도지단백질(LDL) 마커로 표지하고, 이 마커는 내피세포 표면에 선택적으로 흡착됩니다. 내피 세포는 혈관에서 얻은 세포 덩어리, 즉 평활근 세포, 근섬유아세포, 섬유아세포가 혼합된 세포 덩어리로부터 쉽게 분리될 수 있습니다. 동맥인지 정맥인지에 따라 최종 구조물의 특성이 달라집니다. 따라서 정맥 세포를 주입한 기질을 가진 인공 심장 판막은 동맥 세포를 주입한 구조물보다 콜라겐 형성과 기계적 안정성이 우수합니다. 말초 정맥을 선택하는 것이 세포 채취에 더 편리한 것으로 보입니다.

근섬유아세포는 경동맥에서도 채취할 수 있습니다. 그러나 혈관 유래 세포는 천연 간질 세포와 상당히 다른 특성을 가지고 있습니다. 자가 제대혈 세포를 대체 세포원으로 사용할 수 있습니다.

줄기세포 기반 인공 심장 판막

최근 줄기세포 연구를 통해 조직공학의 발전이 촉진되었습니다. 적색 골수 줄기세포를 사용하는 것은 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 특히 생체재료 채취 및 체외 배양, 그리고 다양한 유형의 중간엽 세포로의 분화가 간편하여 온전한 혈관을 사용하지 않아도 됩니다. 줄기세포는 다능성 세포 계통의 공급원이며, 동종 이식 환경에서 안정성을 유지하는 데 기여하는 고유한 면역학적 특성을 가지고 있습니다.

인간 적골수 줄기세포는 흉골 천자 또는 장골능 천자를 통해 얻습니다. 10~15ml의 흉골 천자액에서 줄기세포를 분리하고, 다른 세포와 분리하여 배양합니다. 필요한 세포 수(보통 21~28일 이내)에 도달하면, 기질에 접종(콜로니화)하고, 영양 배지에서 고정된 위치(37°C, 5% CO2 존재 하의 가습 배양기에서 7일)에서 배양합니다. 이후, 배양 배지(생물학적 자극)를 통해 세포 성장을 자극하거나, 맥동 흐름이 있는 재생 장치(생물 반응기)에서 등척성 변형을 통해 조직 성장을 위한 생리적 조건을 조성합니다(기계적 자극). 섬유아세포는 성장과 기능 활동을 촉진하는 기계적 자극에 민감합니다. 맥동하는 흐름은 반경 방향 및 원주 방향 변형을 모두 증가시켜, 세포들이 이러한 응력 방향으로 배향(신장)되도록 합니다. 이는 다시 판막의 방향성 섬유질 구조 형성으로 이어집니다. 일정한 흐름은 벽에 접선 방향 응력만 가합니다. 맥동하는 흐름은 세포 형태, 증식 및 세포외 기질의 구성에 유익한 영향을 미칩니다. 영양 배지 흐름의 특성, 생물 반응기 내 물리화학적 조건(pH, pO₂, pCO₂) 또한 콜라겐 생성에 상당한 영향을 미칩니다. 따라서 층류 및 순환 와전류는 콜라겐 생성을 증가시켜 기계적 특성을 향상시킵니다.

조직 구조를 성장시키는 또 다른 접근법은 인체의 생리적 조건을 시뮬레이션하는 대신 생물반응기에서 배아 환경을 조성하는 것입니다. 줄기세포를 기반으로 성장된 조직 바이오밸브는 생리적 수준을 초과하는 고압 및 유량의 영향 하에서도 기능적으로 기능할 수 있는 이동성 및 유연성을 가진 플랩을 가지고 있습니다. 이러한 구조의 플랩에 대한 조직학적 및 조직화학적 연구는 기질 생물 파괴의 활성 과정과 생존 가능한 조직으로의 대체가 존재함을 보여주었습니다. 조직은 세포외 기질 단백질의 특성이 자연 조직과 유사하고, 콜라겐 I형 및 III형, 그리고 글리코사미노글리칸이 존재하는 층상 구조로 조직되어 있습니다. 그러나 플랩의 전형적인 3층 구조(심실층, 해면층, 섬유층)는 얻어지지 않았습니다. 모든 단편에서 발견된 비멘틴을 발현하는 ASMA 양성 세포는 근섬유아세포와 유사한 특성을 보였습니다. 전자 현미경 검사 결과, 조직 표면에 생존 가능하고 분비 활동이 가능한 근섬유아세포(액틴/미오신 필라멘트, 콜라겐 실, 엘라스틴)와 내피 세포의 특징을 지닌 세포 요소가 있는 것으로 나타났습니다.

판막엽에서 I형, III형 콜라겐, ASMA, 비멘틴이 검출되었습니다. 조직 판막엽과 자연 구조 판막엽의 기계적 특성은 유사했습니다. 조직 인공 심장 판막은 20주 동안 우수한 성능을 보였으며, 미세 구조, 생화학적 특성, 단백질 기질 형성 측면에서 자연 해부학적 구조와 유사했습니다.

조직공학을 통해 얻은 모든 인공 심장 판막은 기계적 특성이 대동맥 위치의 하중과 일치하지 않기 때문에 동물의 폐 위치(pulmonary position)에서 이식되었습니다. 동물에서 적출된 조직 판막은 원래 판막과 구조적으로 유사하며, 이는 생체 내에서 추가적인 발달 및 재구성이 이루어졌음을 시사합니다. 동물 실험에서 관찰된 바와 같이 인공 심장 판막 이식 후 생리적 조건에서 조직 재구성 및 성숙 과정이 지속되는지 여부는 추가 연구를 통해 밝혀질 것입니다.

이상적인 인공 심장 판막은 세포 성장, 영양분 전달, 그리고 세포 대사산물 제거에 필수적인 최소 90%의 다공성을 가져야 합니다. 생체적합성 및 생분해성 외에도, 인공 심장 판막은 세포 파종에 적합한 화학적으로 유리한 표면을 가져야 하며, 자연 조직의 기계적 특성과 일치해야 합니다. 시간이 지남에 따라 기계적 안정성을 보장하기 위해 기질 생분해 수준은 새로운 조직 형성 수준에 비례하여 조절 가능해야 합니다.

현재 합성 및 생물학적 기질이 개발되고 있습니다. 기질을 만드는 데 가장 흔히 사용되는 생물학적 재료는 공여체 해부학적 구조, 콜라겐, 피브린입니다. 고분자 인공 심장 판막은 이식 후, 즉 이식된 세포가 자체적으로 세포외 기질 네트워크를 생성하고 조직화하기 시작하면 생분해되도록 설계되고 있습니다. 새로운 기질 조직의 형성은 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬에 의해 조절되거나 자극될 수 있습니다.

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기증 인공 심장 판막

인간 또는 동물로부터 채취한 기증 인공 심장 판막을 탈세포화하여 면역원성을 감소시킨 후, 세포 항원을 제거하여 기질로 사용할 수 있습니다. 세포외 기질의 보존된 단백질은 이후 접종된 세포의 부착을 위한 기초가 됩니다. 세포 성분 제거(무세포화)에는 동결, 트립신/EDTA 처리, 세제(도데실황산나트륨, 데옥시콜산나트륨, 트리톤 X-100, MEGA 10, TnBR CHAPS, 트윈 20), 그리고 다단계 효소 처리 방법이 있습니다. 이 경우, 콜라겐과 엘라스틴은 보존하면서 세포막, 핵산, 지질, 세포질 구조 및 가용성 기질 분자는 제거됩니다. 그러나 아직 이상적인 방법은 발견되지 않았습니다. 도데실황산나트륨(0.03-1%) 또는 데옥시콜산나트륨(0.5-2%)만이 처리 24시간 후 세포를 완전히 제거했습니다.

동물 실험(개와 돼지)에서 제거된 탈세포화된 바이오판막(동종이식 및 이종이식)의 조직학적 검사 결과, 석회화 징후 없이 부분적인 내피화와 수혜 근섬유모세포의 기저부 내 증식이 관찰되었습니다. 중등도의 염증 침윤이 관찰되었습니다. 그러나 탈세포화된 SynerGraftTM 판막의 임상시험 중 조기 기능 부전이 발생했습니다. 바이오인공판막 기질에서 초기 비특이적 염증 반응이 관찰되었으며, 림프구 반응을 동반했습니다. 1년 동안 바이오인공판막의 기능 장애와 퇴화가 진행되었습니다. 기질 내 세포 증식은 관찰되지 않았지만, 판막과 착상 전 세포 잔여물의 석회화가 관찰되었습니다.

내피세포를 접종하고 시험관 내 및 생체 내 배양한 무세포 기질은 판막 표면에 응집성 층을 형성했으며, 접종된 본래 구조의 간질 세포는 분화 능력을 보였습니다. 그러나 생물반응기의 동적 조건 하에서는 기질에 필요한 생리학적 수준의 세포 집락을 달성할 수 없었으며, 이식된 인공 심장 판막은 세포 증식 가속화 및 세포외 기질 형성으로 인해 상당히 빠른(3개월) 비후를 보였습니다. 따라서 현 단계에서 세포 집락을 위한 공여 무세포 기질의 사용은 면역학적 및 감염학적 문제를 포함한 여러 미해결 문제를 안고 있습니다. 탈세포화된 생체 보형물에 대한 연구는 계속 진행 중입니다.

콜라겐은 생분해 가능한 매트릭스 생산에 사용될 수 있는 잠재적인 생물학적 재료 중 하나라는 점에 유의해야 합니다. 콜라겐은 폼, 젤, 플레이트, 스펀지, 그리고 섬유 기반 블랭크 형태로 사용될 수 있습니다. 그러나 콜라겐 사용에는 여러 기술적 어려움이 따릅니다. 특히 환자로부터 얻는 것이 어렵습니다. 따라서 현재 대부분의 콜라겐 매트릭스는 동물성입니다. 동물성 콜라겐의 느린 생분해는 인수공통전염병 감염 위험을 증가시키고 면역 및 염증 반응을 유발할 수 있습니다.

피브린은 생분해 특성이 조절되는 또 다른 생물학적 물질입니다. 환자의 혈액을 이용하여 피브린 겔을 제조하여 자가 기질을 생성할 수 있으므로, 이러한 구조물을 이식해도 독성 분해 및 염증 반응이 발생하지 않습니다. 그러나 피브린은 환경으로의 확산 및 침출, 낮은 기계적 특성 등의 단점을 가지고 있습니다.

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합성소재로 만든 인공심장판

인공 심장 판막도 합성 재료로 만들어집니다. 판막 매트릭스를 제조하려는 여러 시도는 폴리글락틴, 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), PGA와 PLA의 공중합체(PLGA), 그리고 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)를 사용하는 것에 기반했습니다. 고다공성 합성 재료는 편조 또는 비편조 섬유와 염침출 기술을 사용하여 얻을 수 있습니다. 매트릭스 제조에 유망한 복합 재료(PGA/P4HB)는 폴리-4-하이드록시부티레이트(P4HB)로 코팅된 비편조 폴리글리콜산(PGA) 루프로부터 얻습니다. 이 재료로 제조된 인공 심장 판막은 에틸렌 옥사이드로 멸균됩니다. 그러나 이러한 중합체 루프의 높은 초기 강성과 두께, 산성 세포독성 생성물의 방출을 동반하는 빠르고 조절되지 않는 분해로 인해 추가 연구와 다른 재료에 대한 탐색이 필요합니다.

지지체 위에 배양된 자가 근섬유아세포 조직 배양 플레이트를 사용하여 세포 생성을 자극함으로써 지지 매트릭스를 형성함으로써, 세포외 매트릭스로 둘러싸인 활성 생존 세포를 갖는 판막 샘플을 얻을 수 있었습니다. 그러나 이러한 판막 조직의 기계적 특성은 여전히 이식에 충분하지 않습니다.

생성되는 판막의 필요한 증식 및 조직 재생 수준은 세포와 기질만을 결합하는 것만으로는 달성할 수 없습니다. 세포 유전자 발현 및 조직 형성은 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬, 분열 촉진 인자 또는 접착 인자를 기질과 지지체에 첨가함으로써 조절되거나 자극될 수 있습니다. 이러한 조절 인자를 기질 생체재료에 도입하는 가능성이 연구되고 있습니다. 전반적으로 생화학적 자극에 의한 조직 판막 형성 조절에 대한 연구는 상당히 부족합니다.

무세포 돼지 이종 폐 생체 보형물인 Matrix P는 AutoTissue GmbH의 특수 특허 공정(항생제, 데옥시콜산나트륨, 알코올 처리 포함)을 통해 처리된 탈세포화된 조직으로 구성되어 있습니다. 국제표준화기구(ISO)의 승인을 받은 이 처리 방식은 모든 살아있는 세포와 세포 후 구조(섬유아세포, 내피세포, 박테리아, 바이러스, 진균, 마이코플라스마)를 제거하고, 세포외 기질의 구조를 보존하며, 조직 내 DNA와 RNA 수준을 최소화하여 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV)가 사람에게 전파될 가능성을 완전히 제거합니다. Matrix P 생체 보형물은 구조적 통합을 유지하면서 콜라겐과 엘라스틴으로만 구성되어 있습니다.

양 실험에서, Matrix P 생체인공삽입물 이식 11개월 후 주변 조직으로부터 최소한의 반응이 관찰되었으며, 생존율은 양호했습니다. 특히, 광택이 나는 심내막 내면에서 이러한 반응이 두드러졌습니다. 염증 반응, 판막엽의 비후 및 단축은 거의 나타나지 않았습니다. Matrix P 생체인공삽입물에서 낮은 조직 칼슘 농도 또한 관찰되었는데, 이는 글루타르알데히드로 처리한 경우와 비교하여 통계적으로 유의미한 차이를 보였습니다.

Matrix P 인공 심장 판막은 이식 후 몇 개월 이내에 개별 환자의 상태에 적응합니다.대조 기간이 끝날 때 검사에서 손상되지 않은 세포외 기질과 합류하는 내피가 확인되었습니다.2002년과 2004년 사이 Ross 시술 중 선천적 결함이 있는 50명의 환자에게 이식된 Matrix R 이종이식편은 냉동보존 및 탈세포화된 SynerGraftMT 동종이식편과 글루타르알데히드 처리된 스캐폴드 없는 생체 보철물에 비해 성능이 우수하고 판막 내 압력 기울기가 더 낮았습니다.인공 심장 판막 Matrix P는 선천적 및 후천적 결함에 대한 수술에서 우심실 유출로 재건 중 폐동맥 판막 교체 및 Ross 시술 중 폐동맥 판막 교체 시 사용하도록 설계되었습니다.4가지 크기(내경 기준)로 제공됩니다.신생아용(15-17mm), 소아용(18-21mm), 중급자용(22-24mm), 성인용(25-28mm)입니다.

조직공학 판막 개발의 진전은 판막 세포 생물학(유전자 발현 및 조절 문제 포함), 배아 발생 및 연령 관련 판막 발달 연구(혈관형성 및 신경원성 요인 포함), 각 판막의 생체역학에 대한 정확한 지식, 접종에 적합한 세포 발굴, 그리고 최적의 기질 개발에 달려 있습니다. 더욱 발전된 조직 판막을 개발하기 위해서는 자연 판막의 기계적 및 구조적 특성과 이러한 특성을 체외에서 재현하기 위한 자극(생물학적 및 기계적) 간의 관계에 대한 철저한 이해가 필요합니다.

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